炭疽毒素致死因子的重組制備與檢測方法研究.pdf

1、炭疽是一類嚴(yán)重威脅人類健康的烈性傳染病,其病原體為炭疽芽孢桿菌(簡稱炭疽桿菌)。炭疽桿菌在不適宜的生存條件下會形成具有極強抗逆性的芽孢,其芽孢由于具有存活時間長、易于制備、易于散布等特性,是非常理想的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖的原材料。
　　炭疽桿菌的毒力因子有兩大類,一是莢膜,一是外毒素。莢膜的功能是抵抗宿主的吞噬作用,幫助炭疽桿菌在宿主體內(nèi)感染和生存。而炭疽桿菌的外毒素則被認(rèn)為是其致死的最主要因素,包含三種成分,水腫因子(edema

2、factor,EF),致死因子(lethal factor,LF),保護(hù)性抗原(protective antigen,PA)。其中PA可以與其細(xì)胞表面受體結(jié)合,被furin樣蛋白酶切割并組裝成七聚體或八聚體;EF和LF可以與PA多聚體結(jié)合,形成的復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在胞質(zhì)內(nèi),EF具有腺苷酸環(huán)化酶的活性,能夠上調(diào)cAMP的水平,LF具有金屬蛋白酶的活性,能夠切割MEK蛋白家族的成員。學(xué)界目前對炭疽感染者損傷甚至死亡的具體機(jī)制還不清

3、楚,但認(rèn)為兩類炭疽毒素,致死毒素LT(lethal toxin,即PA與LF的混合物)和水腫毒素ET(edema toxin,即PA與EF的混合物)在其中發(fā)揮著主要作用,這也是炭疽感染晚期單純的抗生素治療難以發(fā)揮療效的原因。
　　因此,在炭疽感染中,準(zhǔn)確檢測毒素水平顯得非常必要:在感染早期,對毒素的檢測可以作為診斷手段;在治療中,實時監(jiān)測毒素水平的變化對于評價治療效果和患者的安全狀況也有重要的意義。
　　LF作為炭疽桿菌外毒

4、素的重要組成部分,是炭疽感染中造成損傷和致死的主要成分之一,因此本研究的主要目標(biāo)之一就是期望建立方便靈敏實用的針對LF的檢測方法。為了給檢測方法研究準(zhǔn)備材料,同時也為了給本室及其他同行關(guān)于LF作用機(jī)理的研究提供支持,本研究將建立簡單高效的LF制備方法作為本研究的另一重要目標(biāo)。
　　目前在LF的制備工作中存在的主要問題包括生物安全風(fēng)險,氨基酸序列尤其是N端序列有異于天然蛋白,純化工藝復(fù)雜、效率不高等。
　　本研究立足于大腸桿菌

5、表達(dá)系統(tǒng),從而降低了生物安全的風(fēng)險。但在實際工作中發(fā)現(xiàn),目的蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平又成為了限制條件。
　　因此,本研究從核酸水平上對LF表達(dá)的限制因素進(jìn)行了分析。通過構(gòu)建一系列的截短突變體進(jìn)行表達(dá)分析,并借助網(wǎng)絡(luò)工具JCat進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)LFC端的編碼序列存在兩個稀有密碼子密集的區(qū)域,推測這兩段序列限制了LF在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平。通過對這兩個區(qū)域的密碼子進(jìn)行優(yōu)化,實現(xiàn)了LF表達(dá)量的提高。
　　在此基

6、礎(chǔ)上,對周質(zhì)蛋白的抽提方式和LF的純化方法進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過優(yōu)化的滲透休克法處理和CHTTM陶瓷羥基磷灰石層析柱與Source 30Q陰離子層析柱兩步層析純化,可以得到純度大于95％的目的蛋白,產(chǎn)量可達(dá)5mg/L。
　　利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡分析、氨基端測序,以及細(xì)胞毒性試驗和大鼠攻毒試驗,對LF進(jìn)行了性質(zhì)鑒定。結(jié)果表明,該方法可以得到純度高(大于95%)、序列天然、活性高的LF,可以滿足炭疽基礎(chǔ)研究、疫苗和防治藥物研

7、究等多種需求。
　　在LF制備工藝建立起來的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步探索了LF的檢測方法?？紤]到LF具有較強的細(xì)胞毒性,本研究關(guān)注了利用LF的細(xì)胞毒性對其進(jìn)行檢測的可行性。小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1細(xì)胞對LF的細(xì)胞毒性非常敏感,因此利用該細(xì)胞檢測LF可能會得到比較理想的靈敏度。本研究首先利用細(xì)胞毒性試驗測定了LF作用于J774A.1細(xì)胞的EC50值,在此基礎(chǔ)上,對檢測過程中的條件進(jìn)行優(yōu)化,建立起了操作簡單、靈敏度高的LF檢測方法。該

8、方法在Fischer344大鼠模型中得到了驗證,并利用該方法,初步計算了LF在Fischer344大鼠血液內(nèi)的半衰期。該部分工作建立了利用細(xì)胞毒性試驗檢測血液中LF的方法,該方法在靈敏性、經(jīng)濟(jì)性和實用性等方面顯示了一定的優(yōu)勢,為炭疽的相關(guān)研究及臨床診斷和治療中的LF檢測提供了新的選擇。
　　為了探索更靈敏更穩(wěn)定的檢測方法,本研究又進(jìn)一步關(guān)注了LF的酶活性。LF作為炭疽致死毒素的酶活性組份,在進(jìn)入細(xì)胞后具有Zn2+依賴的金屬蛋白酶活

9、性,能夠特異地切割MEK蛋白家族的成員。目前,已有多項在研的針對這一性質(zhì)的LF檢測方法,但這些研究往往需要利用質(zhì)譜、高效液相色譜等復(fù)雜的技術(shù)和設(shè)備。本研究期望在此基礎(chǔ)上設(shè)計出一套既靈敏又簡單的LF檢測方法。
　　本研究將MEK中LF的酶切位點部分對應(yīng)的DNA序列添加到大腸桿菌堿性磷酸酶(AP)野生型或突變體的編碼基因的上游,并在融合蛋白的N端添加多聚組氨酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽),成功構(gòu)建了融合蛋白MEKAP的重組表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行了表達(dá)純

10、化。將得到的MEKAP用于LF的檢測:通過一系列類似于酶聯(lián)免疫吸附法的操作,實現(xiàn)了對LF的檢測。本研究設(shè)計的檢測方法不需要質(zhì)譜儀、高效液相色譜等復(fù)雜設(shè)備,其操作流程簡單,可檢測到31ng的目的蛋白,顯示了較好的應(yīng)用前景。
　　綜上所述,本研究首先建立了簡便高效的LF制備工藝,在此基礎(chǔ)上,利用LF的細(xì)胞毒性和酶活性,對其檢測方法進(jìn)行了探索:利用小鼠巨噬細(xì)胞J744A.1對LF細(xì)胞毒性的敏感性,建立了基于細(xì)胞毒性試驗檢測LF的方法,并