海帶多糖抗大鼠頜下腺輻射損傷以及鼻咽癌裸鼠移植瘤的實驗研究.pdf

1、目的:放射治療是鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段。鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤患者放射治療的常規(guī)照射野以兩側(cè)對穿外照射為主，涎腺特別是腮腺位于放療靶區(qū)內(nèi)，輻射造成涎腺組織損傷，引起腺體功能障礙，唾液分泌減少，放療后患者發(fā)生口腔干燥癥，嚴重影響生活質(zhì)量。目前對輻射導致的口干癥仍以綜合對癥治療，缺乏有效防治的措施。研究涎腺輻射誘導的損傷機制，尋找既能對抗輻射又能抑制腫瘤的藥物，對疾病的治療有重要的臨床意義。本研究通過脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的

2、dTP缺口末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)、電鏡病理形態(tài)學、免疫組織化學染色、細胞培養(yǎng)、細胞毒性試驗(MTT法)、裸鼠移植瘤模型、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerasechain reaction，RT-PCR)等檢測技術(shù)，旨在了解不同輻射劑量對大鼠頜下腺輻射誘導損傷的早期（1-3天）情況，在確定輻射誘導涎腺損傷的干預輻射劑量及

3、探討損傷機制后，予以LJP藥物干預以及觀察其對頜下腺輻射損傷是否具有防護作用，再觀察LJP對人鼻咽癌HONE1和CNE2細胞增殖以及人鼻咽癌HONE1裸鼠移植瘤是否有影響，探討LJP抗人鼻咽癌細胞的機制，為LJP的涎腺防輻射和抗鼻咽癌提供實驗依據(jù)。
　　方法:本研究分三部分:第一部分，不同劑量60Coγ射線照射對大鼠頜下腺凋亡相關(guān)因子表達及形態(tài)學的影響;第二部分，海帶多糖對頜下腺60Coγ射線誘導損傷的防護作用;第三部分，海帶多糖

4、對人鼻咽癌細胞株裸鼠移植瘤的抑制作用。第一部分實驗方法:將48只Wistar大鼠隨機分組原則分為:(1)正常對照組(n=12);(2)放療7.5Gy組(n=12);(3)放療15Gy組(n=12);(4)放療22.5Gy組(n=12)。放療組予以每只一次性總劑量15Gy的γ-ray照射，而對照組未予照射。于放療后1d、3d，取各組6只大鼠頜下腺組織固定后冷凍切片，免疫組織化學SP法檢測P53，Caspase-3表達情況以及TUNEL法檢

5、測細胞凋亡。每組隨機取1只頜下腺掃描電鏡(Transmission electron microscope，SEM)檢查，觀察頜下腺的形態(tài)學病理變化。第二部分實驗方法:24只Wistar大鼠隨機分組原則分為:(1)正常對照組(n=6);(2)LJP高劑量放療組（300mg/kg/只/天的LJP）(n=6);(3)LJP低劑量放療組（30m/kg/只/天的LJP）(n=6)。(4)放療對照組(n=6)。于放療前3d、后3d之間予以上述藥物

6、腹腔注射;放療組以每只一次性總劑量15Gy的γ-ray照射，而對照組未予照射。各組6只在放療后第3天上午活體各取大鼠雙頜下腺組織，固定后冷凍切片，免疫組織化學SP法檢測P53，Caspase-3表達情況以及TUNEL法檢測細胞凋亡。15只Wistar大鼠作電鏡觀察，分成7.5Gy、15Gy、22.5 Gy三個劑量組①正常對照組(n=1);②LJP高劑量放療組(n=1);③LJP低劑量放療組(n=1);④放療對照組(n=1);⑤蔗糖陰性對

7、照組(n=1)，同上述方法給藥，在放療后第3天上午活體取大鼠頜下腺組織電鏡檢查，觀察頜下腺的形態(tài)學病理變化。第三部分實驗方法:應(yīng)用MTT法檢測LJP對人NPC細胞株(HONE1和CNE2)增殖的抑制作用。30只雄性裸鼠隨機分為組:①NS(正常對照組:NS0.1ml/10g/d)(n=6);②LJP12.5(LJP12.5mg/kg/d)(n=6);③LJP25(LJP25mg/kg/d)(n=6);④LJP50(LJP50mg/kg/d

8、)(n=6);⑤DDP(陽性對照組: DDP2 mg/kg/d)(n=6)。以人NPC細胞株HONE1建立裸鼠皮下移植瘤模型，以分組的藥物進行體內(nèi)抑瘤實驗，計算抑瘤率，RT-PCR檢測移植瘤凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase-3，8，9信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)的表達。
　　結(jié)果:第一部分:①p53的表達為:7.5 Gyld、3d照射組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);15 Gyld、

9、3d照射組與對照組比較差異有顯著性統(tǒng)計學意義（p＜0.01），22.5Gy3d照射組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);15Gy照射組1d和3d間的比較差異有顯著性統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，7.5 Gy、22.5 Gy照射組1d與3d間的比較差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。②Caspase-3表達為:7.5 Gy、22.5 Gy照射組1d和3d、15 Gy照射組3d與對照組比較差異有顯著性統(tǒng)計學意義(p＜0.01);15

10、Gy照射組1d與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。15 Gy照射組1d與3d間的比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);7.5Gy、22.5Gy照射組1d與3d間的比較差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。③tunel染色表達為:7.5Gy照射組3d和正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);15 Gy照射組1d、22.5 Gy照射組1d、3d與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);15 Gy照射組3d與對照組比較差異有顯著

11、統(tǒng)計學意義(p＜0.01);7.5G、15 Gy、22.5 Gy照射組1d與3d比較差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);7.5G、15 Gy、22.5 Gy照射組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。④電鏡觀察結(jié)果:7.5Gy放療組漿液性腺泡細胞及導管細胞，核膜完整，核仁消失，核內(nèi)異染色質(zhì)凝集成塊狀并邊集于核膜內(nèi)側(cè)，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，線粒體稍腫脹，嵴模糊不清。導管細胞，可見細胞膜皺縮，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，嵴斷裂、減少或消失，胞核

12、完整，核仁清晰。15Gy放療組漿液性腺泡細胞及導管細胞，細胞皺縮，電子密度增高，核膜完整，核仁消失，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯增多、凝集成塊狀并邊集于核膜內(nèi)側(cè);粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯減少并擴張，分泌顆粒亦減少明顯，且顆粒內(nèi)排列紊亂，線粒體結(jié)構(gòu)模糊不清。22.5Gy放療組漿液性腺泡細胞及導管細胞，細胞皺縮，電子密度增高，核膜不完整，核內(nèi)異染色質(zhì)凝集成塊狀并邊集于核膜內(nèi)側(cè)，核周隙增寬;胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量減少，并擴張明顯，結(jié)構(gòu)紊亂，分泌顆粒消失，殘余少量線粒

13、體，核內(nèi)異染色質(zhì)開始增多。第二部分:①p53的表達為:放療組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);放療組組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，高劑量LJP組的細胞凋亡值最低。②Caspase-3表達結(jié)果為:放療組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05); LJP30組與LJP300組比較差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，LJP30組、LJP300組與放療組比較減少差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。③TUNEL染色結(jié)果為:

14、LJP30、LJP300組與放療組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);LJP30組與LJP300組比較差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。④電鏡觀察結(jié)果:7.5Gy、15 Gy、22.5 Gy三組的細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及分泌泡等結(jié)構(gòu)隨著劑量的增加，呈現(xiàn)損傷加重的特征，LJP30、LJP300組細胞與放療對照、蔗糖對照組比較，細胞結(jié)構(gòu)損傷較輕，對細胞有保護作用。第三部分:①MTT結(jié)果:LJP對HONE1細胞的IC10為76.85μg/

15、ml，IC20為115.31μg/ml，IC30為153.77μg/ml; LJP對CNE2細胞的IC10為18.92μg/ml，IC20為57.38μg/m1，IG30為98.85μg/ml。LJP對HONE1細胞、CNE2細胞IC50濃度分別為240μg/ml、180μg/ml。②裸鼠移植瘤的干預結(jié)果:DDP組的平均抑瘤率為63.5％(與NS組比較，p＜0.01)，12.5mg/kg LJP組對移植瘤的平均抑瘤率僅為16.4％(與N

16、S組比較，p＞0.05)，抑制效果不明顯，而25mg/kg和50mg/kg LJP組對移植瘤的平均抑瘤率分別為33.7％(與NS組比較，p＜0.05)和47.0％（與NS組比較，＜0.01）。③RT-PCR: LJP12.5、LJP25、LJP50、DDP2組的Bax mRNA表達與對照組NS比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);LJP12.5、LJP25、LJP50、DDP2組的Bcl-2mRNA表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜

17、0.05);LJP12.5、LJP25、LJP50、 DDP2組的Bax/Bcl-2比值與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);Bax mRNA表達:LJP25＞ LJP50＞ LJP12.5＞DDP2，組間的比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05); Bcl-2mRNA表達:LJP25/LJP12.5＞LJP50＞DDP2，組間的比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。LJP12.5、LJP25、LJP50、DDP2組Caspase-

18、3、Caspase-9 mRNA表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);LJP25、LJP50、DDP2組Caspase-8 mRNA表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。Caspase-3 mRNA表達:DDP2＞LJP50＞LJP25＞LJP12.5，各組之間表達比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05):Caspase-8mRNA表達:NS組和LJP12.5組無差異，LJP25、LJP50表達無差異，LJP25、D

19、DP2表達無差異;Caspase-9mRNA表達:LJP12.5、LJP25、LJP50表達均無差異，且均低于DDP2處理組的表達。
　　結(jié)論:
　　1.60Coγ射線照射可引起大鼠頜下腺早期細胞凋亡。
　　2.60Coγ射線(7.5Gy、15 Gy、22.5 Gy)照射誘導的頜下腺細胞凋亡有劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　3.15 Gy照射劑量誘導的頜下腺細胞損傷在早期（1-3天）處于修復和凋亡的變動階段。
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