靶向腫瘤血管的自殺基因聯(lián)合放射治療鼻咽癌裸鼠移植瘤的研究.pdf

1、研究背景 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)又稱(chēng)“廣東瘤”，是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前NPC主要的治療手段是放射治療，隨著放射治療技術(shù)的不斷提高和放化療的綜合應(yīng)用，NPC的5年生存率仍徘徊于50﹪～60﹪。由此可見(jiàn)，NPC臨床上需探討新的治療模式以改善其5年生存率。近年來(lái)，隨著對(duì)NPC等多種腫瘤發(fā)病機(jī)制及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)理研究的深入，研究者提出將基因治療與其它傳統(tǒng)抗癌策略如放射治療、化學(xué)治療、免

2、疫治療等相結(jié)合，希望獲得增強(qiáng)或協(xié)同的抗癌作用，其中自殺基因系統(tǒng)與放射治療聯(lián)合在多種實(shí)體瘤的治療上是較有前景的一種方案。但目前的自殺基因系統(tǒng)大多是直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞的治療方式。 已有研究表明VEGF及KDR在NPC組織中高表達(dá)，且與NPC腫瘤血管的形成呈正相關(guān)。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)KDR啟動(dòng)子調(diào)控的自殺基因可在NPC血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并具有靶向殺傷NPC血管的能力。因此，放射聯(lián)合靶向NPC微血管內(nèi)皮細(xì)胞自殺基因系統(tǒng)(AdKDR-tk

3、/GCV system)治療能否改善并提高NPC的局控率和生存率值得探討。研究目的將由腺病毒(Adenovirus)載體介導(dǎo)的、KDR基因啟動(dòng)子調(diào)控的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-tk)表達(dá)的自殺基因系統(tǒng)(AdKDR-tk/GCV System)轉(zhuǎn)入荷瘤裸鼠的人NPC移植瘤內(nèi)，同時(shí)聯(lián)合<'60>Co γ射線腫瘤局部外照射，評(píng)價(jià)外照射和AdKDR-tk/GCV

4、自殺基因系統(tǒng)對(duì)NPC是否具有協(xié)同殺傷作用以及作用的大小，為NPC的臨床治療提供新思路和方法。 材料和方法 1細(xì)胞培養(yǎng) 1．1細(xì)胞株人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株。 1．2實(shí)驗(yàn)材料RPMI 1640培養(yǎng)基、超凈工作臺(tái)、78-1型電熱恒溫培養(yǎng)箱等。 1．3實(shí)驗(yàn)方法將CNE-2人鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞株置于10﹪小牛血清的“RPMI”1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并于培養(yǎng)液中加入青霉素100 U/ml，鏈霉素100mg/m

5、l。傳代一周，待細(xì)胞長(zhǎng)成滿(mǎn)瓶時(shí)，用0.25﹪胰蛋白酶和0.02﹪。EDTA(乙二胺四乙酸)，按1：1混合配成消化液，制成每毫升含5×10<'6>個(gè)細(xì)胞懸液。 2重組腺病毒構(gòu)建(由北京大學(xué)深圳醫(yī)院李寶金博士構(gòu)建)2．1實(shí)驗(yàn)材料pBluescript ⅡKDR-tk、穿梭質(zhì)粒ptrack、腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1及胚胎腎細(xì)胞系293細(xì)胞等。 2．2實(shí)驗(yàn)方法采用pAdeasy系統(tǒng)，按定向克隆方法將KDR-tk片段正向插入表

6、達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間，構(gòu)建受KDR啟動(dòng)子調(diào)控并可表達(dá)HSV-tk基因的pAdKDR-tk，在293細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增。 3裸鼠鼻咽癌移植瘤模型的建立3．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C近交系裸鼠32只，雌雄各半，4-6周齡，體重15-20克。 3．2實(shí)驗(yàn)材料1ml醫(yī)用注射器和裸鼠飼養(yǎng)房等。 3．3實(shí)驗(yàn)方法將含1×10<'6>個(gè)(0.2 ml)CNE-2細(xì)胞的懸液注射到裸鼠背側(cè)右后肢上部皮下后，于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心二級(jí)以上動(dòng)

7、物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，并定期觀察記錄移植瘤生長(zhǎng)情況。 4動(dòng)物分組和治療4．1實(shí)驗(yàn)材料重組腺病毒系統(tǒng)(AdKDR-tk system)、丙氧鳥(niǎo)苷(g8nciclovir， GCV)、780C型<'60>Co機(jī)等。 4．2實(shí)驗(yàn)方法4．2．1動(dòng)物分組CNE-2細(xì)胞接種結(jié)束后第14天時(shí)，全部成瘤，大小約200ram<'3>，將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為自殺基因聯(lián)合放射治療組(Ⅰ組：AdKDR-tk+GCV+Radiation)、

8、放射治療組(Ⅱ組：Radiation+PBS)、自殺基因治療組 (Ⅲ組：AdKDR-tk+GCV)和空白對(duì)照組(Ⅳ組：AdKDR-tk+PBS)。 4．2．2治療分別對(duì)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組裸鼠瘤體內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)注射重組腺病毒液共0.2m1，此后24小時(shí)和第7天各重復(fù)注射一次重組腺病毒液。第二次注射病毒液時(shí)，同時(shí)向Ⅰ、Ⅲ組小鼠腹腔注射GCV 100 mg/kg，Ⅱ、Ⅳ組小鼠腹腔注射PBS100mg/kg，每日一次，連續(xù)14天。其中Ⅰ、Ⅱ組小鼠

9、分別于腹腔注射GCV和PBS后12小時(shí)以水合氯醛300mg/kg腹腔內(nèi)注射，麻醉后施行<'60>Co γ射線局部外照射裸鼠移植瘤(1 cm寬條形放射野照射瘤體)，225倫琴/分鐘，2Gy/次，隔日外照射一次，共7次，外照射總劑量14Gy。 4．2．3動(dòng)態(tài)觀察記錄裸鼠移植瘤生長(zhǎng)大小治療前l(fā)天及治療開(kāi)始后的第3天，第6天，第9天，第12天，第15天，第18天及第21天測(cè)量瘤體垂直長(zhǎng)徑和短徑，繪制瘤體生長(zhǎng)曲線。 4．2．4處死

10、裸鼠、剝離腫瘤并測(cè)量實(shí)體瘤質(zhì)量治療結(jié)束后第8天處死裸鼠，剝離瘤塊并稱(chēng)重，計(jì)算各組的腫瘤質(zhì)量抑制率。 4．2．5取材、收集標(biāo)本腫瘤稱(chēng)重結(jié)束后將其浸泡于4﹪多聚甲醛中固定，保存標(biāo)本備用。 5常規(guī)病理學(xué)檢查5．1實(shí)驗(yàn)材料蘇木素、伊紅、乙醇、二甲苯、OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、真空干燥箱、組織切片機(jī)等。 5．2實(shí)驗(yàn)方法采用切片、脫蠟、蘇木素、伊紅染色及脫水步驟。 6免疫組化染色6．1實(shí)驗(yàn)材料鼠抗人CD34單克隆抗體

11、、B10TINYLATED-GOAl、IgG(H+L)、親合素-過(guò)氧化酶復(fù)合物、電子天平、真空干燥箱、微量可調(diào)移液器、微波爐等。 6．2實(shí)驗(yàn)方法6．2．1免疫組化采用ABC法步驟采用切片、脫蠟、抗原修復(fù)、滴加一抗、二抗及親合素-過(guò)氧化酶復(fù)合物和復(fù)染蘇木素步驟。 6．2．2免疫組化CD34結(jié)果判定分別于低倍鏡(×40)和高倍鏡(20×10)下按 weidner方法計(jì)數(shù)腫瘤微血管密度(Microvessel density，

12、MVD)。 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，瘤體體積、質(zhì)量及MVD值均以x±S表示，組問(wèn)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。 結(jié)果 1 pBluescript Ⅱ KDR-tk鑒定經(jīng)Xho Ⅰ/Sal Ⅰ酶切后，顯示為兩條片段，分別為2.2kb和2.96kb，大小及測(cè)序結(jié)果與提供資料相符。 2重組腺病毒質(zhì)粒pAdKDR-tk鑒定重組pAdKDR-tk經(jīng)Pac Ⅰ酶切，顯示的2個(gè)片段大小

13、與預(yù)期值(4.5kb和37kb)一致。 3重組腺病毒的產(chǎn)生及滴度測(cè)定重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞有GFP表達(dá)。經(jīng)3次293細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增、CsCl梯度離心后，測(cè)定病毒滴度為1×10<'10>pfu/ml。 4重組腺病毒的鑒定PCR分析外源基因的整合按標(biāo)準(zhǔn)方法抽提病毒基因組DNA，取1 μl進(jìn)行PCR，結(jié)果表明病毒載體介導(dǎo)tk基因整合至重組腺病毒基因組中。 RT-PCR分析外源基因的表達(dá)采用T

14、RIzol試劑盒，抽提293細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCP反應(yīng)，可見(jiàn)擴(kuò)增的片段，表明tk基因在mRNA水平上能有效的表達(dá)。 5裸鼠人NPC移植瘤生長(zhǎng)曲線癌細(xì)胞系接種在BALB/C裸鼠兩周全部成瘤。治療前各組腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)治療后第3天起小鼠瘤體體積發(fā)生變化，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ組裸鼠移植瘤體積小于Ⅳ組裸鼠腫瘤體積，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第6天前，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ組問(wèn)裸鼠腫瘤大小無(wú)顯著差異性(P>0.05

15、)；從第9天起，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ組間腫瘤體積大小由大到小依次為Ⅲ組、Ⅱ組和Ⅰ組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 6腫瘤質(zhì)量抑制率結(jié)果顯示Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組的腫瘤質(zhì)量小于Ⅳ組腫瘤質(zhì)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且Ⅰ組的腫瘤質(zhì)量抑制率為84.39﹪，高于Ⅱ、Ⅲ組的70.88﹪和58.43﹪，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ⅱ組腫瘤質(zhì)量抑制率高于Ⅲ組，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)：綜合治療組明顯優(yōu)于單純放

16、療或自殺基因治療組。 7常規(guī)病理檢查結(jié)果空白對(duì)照組癌細(xì)胞體積大，呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，胞漿界限不清，細(xì)胞呈團(tuán)塊狀或片巢狀不規(guī)則排列，可見(jiàn)泡狀核，部分細(xì)胞見(jiàn)明顯核仁。放射治療聯(lián)合自殺基因治療組NPC細(xì)胞數(shù)目較單一放療組、單純自殺基因治療組和空白對(duì)照組NPC細(xì)胞數(shù)目減少，癌細(xì)胞呈退行性變，見(jiàn)大量核碎裂。 8免疫組化CD34微血管計(jì)數(shù)結(jié)果CD34．陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜中。治療結(jié)束后空白對(duì)照組及治療組

17、免疫組化染色均可見(jiàn)腫瘤間質(zhì)內(nèi)染成棕褐色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞簇的微血管。 結(jié)論 1．利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染HSV-tk基因聯(lián)合放射治療BALB/C近交系荷人NPC裸鼠可明顯抑制瘤體生長(zhǎng)，且抑制程度優(yōu)于單一放療或自殺基因治療組(P<0.05)，治療后腫瘤質(zhì)量抑制率高于單一放療或自殺基因治療組(P<0.05)。 2．免疫組化CD34微血管計(jì)數(shù)顯示聯(lián)合治療組MVD平均值為2.73±0.30，小于單一放療組或自殺基因治療