調(diào)節(jié)性T細(xì)胞輸注移植對缺血性腦卒中tPA溶栓后出血轉(zhuǎn)換的治療作用及其機(jī)制探討.pdf

1、研究目的:血腦屏障(BBB)破壞是導(dǎo)致缺血性腦卒中嚴(yán)重后果的主要因素之一。組織纖溶酶原激活物(tPA)作為唯一被認(rèn)可的缺血性腦卒中的溶栓治療藥物，在溶栓治療缺血性腦卒中的同時，可以惡化BBB的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致出血轉(zhuǎn)換(Hemorrhagic transformation，HT)的發(fā)生。因此非常有必要開發(fā)新型的BBB保護(hù)藥物，減少缺血再灌注損傷，提高tPA治療的安全性。我們近期的研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)輸注移植可以通過保護(hù)BBB從

2、而有效保護(hù)缺血性腦卒中后腦組織。本研究旨在進(jìn)一步探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)輸注移植是否同樣可以通過有效保護(hù)BBB，而減少tPA溶栓治療導(dǎo)致的出血轉(zhuǎn)換，提高其使用安全性，并進(jìn)一步探討Tregs對缺血性腦卒中損傷后血腦屏障的保護(hù)作用機(jī)制。
　　研究方法:缺血性腦卒中模型采用小鼠MCAO缺血2h再灌注模型。tPA(10mg/kg)在MCAO后通過股靜脈緩慢（＞20分鐘）注入受體鼠體內(nèi)。從供體小鼠血和脾臟內(nèi)分離提取Treg細(xì)胞，注完t

3、PA后立即將Treg細(xì)胞注入受體小鼠股靜脈內(nèi)。腦出血量用血紅蛋白分光光度計法定量。MCAO術(shù)后24小時評價血腦屏障的完整性。腦組織梗死或缺損體積檢測以及神經(jīng)功能評價持續(xù)至術(shù)后21天。為了探究Treg對BBB的保護(hù)作用機(jī)制，我們在體外實驗中運用transwell細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或者細(xì)胞直接共培養(yǎng)系統(tǒng)將Treg細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分開或者混合共培養(yǎng)。局灶性缺血性腦卒中模型采用缺血60分鐘小鼠MCAO模型。從供體小鼠（野生型或者PD-L1-/-型）體

4、內(nèi)分離提取Treg細(xì)胞(2x106)，在MCAO再灌2h后靜脈注入受體小鼠。術(shù)后1天或3天進(jìn)行MMP-9表達(dá)量，BBB完整性以及腦梗死的評價。
　　研究結(jié)果:小鼠MCAO模型缺血性腦卒中2小時再灌注后靜脈注入tPA，術(shù)后24小時在缺血區(qū)可以看到明顯的出血轉(zhuǎn)換。Treg細(xì)胞輸注移植后可以顯著減少tPA引發(fā)的缺血性腦卒中后出血轉(zhuǎn)換。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Treg輸注移植可以減少血漿滲出至腦組織的IgG以及外源性Evens blue的量，另外

5、免疫組織熒光染色結(jié)果顯示，Treg輸注移植還有助于保存緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和Claudin-7等的完整性，這些結(jié)果說明Treg輸注移植可以有效減少tPA溶栓治療誘發(fā)的BBB的破壞。通過明膠酶譜方法和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，Treg通過減少外周血和腦內(nèi)MMP-9的水平和活性，達(dá)到有效抑制BBB破壞的保護(hù)作用。同時，Treg輸注移植還可有效減少局灶性缺血性腦卒中tPA溶栓治療后腦組織梗死或缺損體積，并能顯著改善神經(jīng)功能，持續(xù)至術(shù)后21天。體外

6、實驗結(jié)果顯示Treg細(xì)胞抑制中性粒細(xì)胞源性MMP-9的作用必須通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸實現(xiàn)。當(dāng)Tregs經(jīng)過PD-L1中和抗體預(yù)處理或者中性粒細(xì)胞經(jīng)過PD-1中和抗體預(yù)處理后，Treg細(xì)胞抑制MMP-9的作用消除。體內(nèi)試驗中，Treg細(xì)胞用PD-L1中和抗體預(yù)處理，或者取自PD-L1基因敲除小鼠體內(nèi)的Treg細(xì)胞靜脈輸注入MCAO受體小鼠體內(nèi)l天后，血液中中性粒細(xì)胞表達(dá)MMP-9沒有得到明顯抑制。另外，在PD-L1功能完整的受體小鼠，Tr

7、eg細(xì)胞保護(hù)血腦屏障的作用效果明顯，但是在PD-L1功能缺陷的受體小鼠，Treg細(xì)胞保護(hù)血腦屏障的作用效果不明顯，PD-L1功能缺陷可消除Treg細(xì)胞的腦保護(hù)作用，影響MCAO后3天的神經(jīng)功能改善。
　　研究結(jié)論:我們研究結(jié)果表明Treg輸注移植能有效減少缺血性腦卒中tPA溶栓再灌治療導(dǎo)致的BBB破壞以及出血轉(zhuǎn)換。Treg細(xì)胞療法很有潛力成為提高tPA溶栓再灌治療安全性的有效輔助策略。此外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)PD-L1通過介導(dǎo)Tre