體外擴增的調(diào)節(jié)性T細胞過繼轉(zhuǎn)輸對缺血性腦卒中的保護作用及抗炎機制.pdf

1、實驗目的:
　　1.建立大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells， Tregs)的分離和體外擴增方法，并檢測分離的和擴增的Tregs純度、活性及其免疫抑制活性。
　　2.探討體外擴增的Tregs靜脈輸注移植對大鼠缺血性腦卒中的保護作用。
　　3.研究體外擴增的Tregs輸注移植后腦缺血再灌注大鼠固有的和入侵的炎癥細胞的變化，并探討Tregs對腦缺血后神經(jīng)炎癥反應的抑制作用。
　　研

2、究方法:
　　1.采用免疫磁珠細胞分選(Magnetic cell sorting，MACS)兩步法從健康成年SD大鼠脾臟和淋巴結(jié)中提取CD4+CD25+Tregs，然后加入刺激因子anti-CD3、anti-CD28、IL-2以及雷帕霉素與之共培養(yǎng)進行體外擴增。用流式細胞儀測定分離的以及培養(yǎng)的細胞中Tregs的純度，臺盼藍染色法檢測細胞的活性，體外增殖抑制試驗測定新鮮分離的和擴增的Tregs的增殖及其抑制功能。
　　2.線

3、栓法制備右側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，缺血2h再灌注。實驗大鼠隨機分成假手術(shù)組、PBS處理組、脾細胞(SP)處理組和Treg細胞治療組。在Treg細胞輸注后3d、7d、14d采用Zea Longa、觸須誘導的前肢放置試驗、足失誤試驗、圓筒實驗對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分;于術(shù)后2w采用水迷宮實驗評價各組大鼠的空間認知能力;行TTC染色和甲酚紫染色測量腦梗死體積比以及采用干濕稱重法測量腦組織含水量;免疫熒光染色法檢測缺血腦組織Casp

4、ase-3的表達情況;Fluro-JadeB染色觀察神經(jīng)元退化情況。
　　3.模型處理和分組同前。于Treg細胞輸注后3d、14d采用免疫熒光和免疫組化染色觀察MPO、Ibal、GFAP在腦組織的表達情況以檢測Treg細胞輸注后對中性粒細胞(MPO)向腦部的浸潤以及腦固有細胞如小膠質(zhì)細胞(Ibal)和星形膠質(zhì)細胞(GFAP)的反應性的影響，并采用Werstern Blot方法進一步驗證各組大鼠腦組織中Ibal、GFAP的表達情況。

5、
　　結(jié)果:
　　1.MACS分選獲得的CD4+CD25+ regulatory T細胞的純度是84.50±5.08％，細胞存活率為95.22±2.97％。經(jīng)過3周體外培養(yǎng)擴增，Tregs的純度為76.03+4.04％，細胞存活率為94.31±3.14％。體外增殖抑制實驗表明Tregs能顯著抑制CD4+CD25-T細胞的增殖(P＜0.01)，體外擴增的Tregs的抑制功能超過新鮮分離的細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

6、。
　　2.腦缺血再灌注后3d，模型組大鼠各項神經(jīng)功能評分達到高峰，與PBS組和SP組相比Tregs治療組的感覺運動功能得到顯著改善。Morris Water Maze test顯示在MCAO后14d，Tregs治療組的空間學習和記憶能力較PBS組和SP組均有顯著改善。TTC染色和甲酚紫染色結(jié)果顯示在MCAO后不同時間點Treg治療組的腦梗死體積較PBS和SP處理組均顯著降低。在MCAO后不同時間點，Tregs治療組的腦組織含水量

7、較PBS和SP處理組均有明顯改善;Caspase-3、Fluro-JadeB染色結(jié)果顯示Tregs治療組腦缺血半暗帶區(qū)的陽性細胞數(shù)目較PBS和SP處理組顯著降低。
　　3.免疫熒光染色觀察腦組織中中性粒細胞的浸潤情況，結(jié)果顯示假手術(shù)組無或可見少量散在分布的MPO+細胞，PBS組和SP組MPO+細胞在缺血再灌注1-3d時向腦部浸潤明顯，Tregs治療組的MPO+細胞數(shù)顯著降低。免疫組化和免疫熒光染色結(jié)果顯示在腦缺血2w時Tregs治

8、療組Ibal陽性和GFAP陽性細胞數(shù)較PBS和SP處理組顯著降低，WesternBlot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗建立的分離和擴增大鼠CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的方法，可有效的獲得高純度、有活力且不影響其抑制功能的Treg細胞。
　　2.擴增的CD4+CD25+Tregs治療性輸注可顯著降低大腦中動脈阻塞腦缺血再灌注后腦梗死體積，降低凋亡及退化的神經(jīng)元數(shù)目，并顯著改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)