缺血性腦卒中后提高BMSCs移植存活率及其療效途徑與機(jī)制探討.pdf

1、目的:干細(xì)胞移植一直是諸多腦損傷疾?。òX卒中）治療應(yīng)用的研究熱點(diǎn)，但其移植后的活力及其功能效率低下是干細(xì)胞治療效果不佳的主要原因之一。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia-Inducible-Factor-1-alpha，HIF-1α）是細(xì)胞處于低氧環(huán)境狀態(tài)下的一個(gè)較敏感分子。HIF-1α可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡，而關(guān)于HIF-1α對(duì)干細(xì)胞特別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells

2、，BMSCs)移植治療腦卒中的療效影響及機(jī)制尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)在BMSCs細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HIF-1α，研究HIF-1α對(duì)BMSCs存活的影響以及是否可以提高BMSCs移植后的活力及其功能效率，探討影響B(tài)MSCs移植治療腦卒中療效的相關(guān)因素及相應(yīng)機(jī)制。
　　方法:本研究分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)中，以CD29、CD90、CD105、CD45為主要標(biāo)志物，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs;用HIF-1α綠色熒光蛋白（HIF-1α-

3、green fluorescent protein，HIF-1α-GFP）慢病毒載體感染BMSCs，并將BMSCs置于氧-糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)條件下(37℃恒溫，以體積比50mL CO2/L+950mL N2/L混合氣充氣30min，用于平衡pH值），無(wú)氧無(wú)糖培養(yǎng)BMSCs2h;采用四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)BMSCs細(xì)

4、胞存活率、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、電鏡檢測(cè)BMSCs細(xì)胞自噬的超微結(jié)構(gòu)、Western Blot檢測(cè)HIF-1α、凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);使用腺苷酸活化蛋白激酶[Adenosine5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]的選擇性抑制劑即Compound C阻斷信號(hào)通路，檢測(cè)HIF-1α過(guò)表達(dá)是否通過(guò)激活A(yù)MPK、抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶（mammalian

5、 target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路而起到調(diào)控凋亡和自噬的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將HIF-1α過(guò)表達(dá)的BMSCs移植到大腦中動(dòng)脈閉塞模型(Middle Cerebralartery Occlusion，MCAO)大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi)，采用熒光顯微鏡觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞率，氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色法檢測(cè)大鼠顱腦梗死體積，改良大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modifi

6、ed neurological severity score，mNSS)評(píng)估BMSCs移植后的大鼠的神經(jīng)功能，Western Blot檢測(cè)BMSCs移植后相關(guān)細(xì)胞因子的變化。
　　結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果:其中CD29(96.72％)、CD90(98.53％)、CD105(98.99％)陽(yáng)性表達(dá);CD45(0.53％)陰性表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示HIF-1α-GFP在BMSCs細(xì)胞中穩(wěn)

7、定轉(zhuǎn)染，與對(duì)照組相比，HIF-1α的mRNA和蛋白水平明顯升高。MTT、TUNEL和流式結(jié)果顯示:細(xì)胞在OGD條件下BMSCs存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡明顯增加，而上調(diào)BMSCs細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)可以顯著增強(qiáng)BMSCs的細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡。在OGD誘導(dǎo)后凋亡蛋白Caspase-9、Bax的蛋白表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl的蛋白表達(dá)下調(diào)。在OGD條件下，HIF-1α過(guò)表達(dá)可抑制Caspase-9和Bax的表達(dá)，促

8、進(jìn)Bcl-2，Bcl-xl的表達(dá)。電鏡檢測(cè)顯示:在OGD誘導(dǎo)后，在HIF-1α過(guò)表達(dá)的BMSCs細(xì)胞中觀察到較多的自噬體和自體溶酶體，并且HIF-1α過(guò)表達(dá)促進(jìn)了LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白的表達(dá)，抑制了P62蛋白的表達(dá)。為進(jìn)一步探索HIF-1α調(diào)控BMSCs調(diào)控凋亡和自噬的機(jī)制，Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):HIF-1α促進(jìn)了OGD處理后細(xì)胞AMPK蛋白的磷酸化，并對(duì)mTOR磷酸化則產(chǎn)生抑制作用，而AMPK磷酸化抑制劑compo

9、und C逆轉(zhuǎn)了HIF-1α對(duì)mTOR磷酸化的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，相較于正常的BMSCs移植組，HIF-1α過(guò)表達(dá)的BMSCs移植組GFP陽(yáng)性率升高，腦梗塞體積縮小更明顯，mNSS評(píng)分更佳，腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor-a，TNF-α）、白介素1β(interleukin1β，IL1β)、IL-6炎性因子表達(dá)減少，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，B