慢病毒介導(dǎo)豬HO-1提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活率及治療缺血性心肌病的機(jī)制研究.pdf

1、背景：面對(duì)終末期心臟病，目前的治療策略只是延緩心臟功能衰竭的發(fā)生。而干細(xì)胞這個(gè)近十余年來(lái)的研究熱點(diǎn)有著自我再生和分化的潛能，因此被期待能取代和修復(fù)損傷的心肌組織。曾經(jīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞移植后可以增加心梗區(qū)血管密度，抑制心室重構(gòu)，甚至可能分化為心肌細(xì)胞，從而達(dá)到改善心功能的目的。但是許多臨床研究卻表明干細(xì)胞治療心功能衰竭的作用是有限的?？赡艿脑蚴歉杉?xì)胞的存活非常依賴于所種植的微環(huán)境，主要由于缺血、缺氧和凋亡前體蛋白的大量分

2、泌致使移植到缺血心肌區(qū)域的干細(xì)胞存活率極低，據(jù)研究到了第4天只有1％的存活率，所以嚴(yán)重制約了其療效。實(shí)驗(yàn)證實(shí)HO-1基因具有抗炎、抗氧化、能明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用。因此，我們運(yùn)用基因重組豬HO-1，轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，研究在體內(nèi)外的缺血缺氧條件下，HO-1能否具有抗炎、抗氧化、抑制干細(xì)胞的凋亡的作用，從而提高干細(xì)胞存活率，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討HO-1修飾的干細(xì)胞治療缺血性心肌病的機(jī)理。
　　第一部分豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、

3、培養(yǎng)和心梗模型的建立
　　目的：從豬骨髓中分離出具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）以及建立豬的心梗動(dòng)物模型。
　　第一節(jié)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分離、培養(yǎng)
　　目的：建立豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為干細(xì)胞移植提供材料。
　　方法：豬的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化、原代傳代培養(yǎng)，免疫熒光行表型鑒定。
　　結(jié)果：體外培養(yǎng)的原代MSCs11～1

4、4d達(dá)到融合；免疫熒光表型鑒定提示CD44和CD105陽(yáng)性。
　　結(jié)論：根據(jù)其黏附特性分離的豬 MSCs在體外培養(yǎng)的條件下可以生長(zhǎng)和擴(kuò)增，并可用于干細(xì)胞的移植。
　　第二節(jié)豬心肌梗死模型的建立
　　目的：經(jīng)心導(dǎo)管用明膠海綿栓子栓塞豬的冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD），建立豬的心肌梗死模型。
　　方法：靜脈麻醉后經(jīng)股動(dòng)脈置入心導(dǎo)管至冠狀動(dòng)脈左前降支第二對(duì)角支，用明膠海綿栓塞。4周后行血流動(dòng)力學(xué)、心臟超聲、核素顯像、冠狀動(dòng)

5、脈造影及組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，心梗（MI）組左室發(fā)展壓（LVDP）降低（P<0.05），±dp/dtmax下降（P<0.05）。心梗（MI）組左室EF下降明顯（P<0.05）。心肌核素顯像提示心梗組血流灌注嚴(yán)重不足。復(fù)查冠脈造影提示第二對(duì)角支處栓塞仍在。組織學(xué)檢查提示MI組左室前壁形成了透壁梗死灶。
　　結(jié)論：運(yùn)用明膠海綿栓塞冠狀動(dòng)脈成功建立豬心肌梗死的模型，符合臨床病理生理要求，安全有效。
　　第二部

6、分 HO-1慢病毒載體的構(gòu)建和HO-1基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及檢測(cè)
　　第一節(jié)構(gòu)建HO-1慢病毒載體
　　目的：構(gòu)建HO-1慢病毒載體。
　　方法：根據(jù)Genbank公布的豬HO-1cDNA，合成HO-1序列，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確后，在293T細(xì)胞中包裝成為重組HO-1慢病毒，并進(jìn)行PCR鑒定及滴度測(cè)定。
　　結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)豬HO-1構(gòu)建成功，PCR檢測(cè)重組慢病毒包裝成功，病毒滴度為3.6×10

7、8tu/ml。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建HO-1慢病毒包裝載體。
　　第二節(jié)慢病毒介導(dǎo)HO-1基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及檢測(cè)
　　目的：觀察慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)的豬HO-1基因轉(zhuǎn)染豬MSCs，細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)情況以及對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響。
　　方法：用慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)的HO-1基因轉(zhuǎn)染豬MSCs，通過(guò)熒光顯微鏡觀察并繪制轉(zhuǎn)染HO-1基因的MSCs（HO-1-MSCs組）、未轉(zhuǎn)染HO-1基因的MSCs（MSCs組）生長(zhǎng)曲線，觀

8、察慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)MSCs增殖的影響。通過(guò)提取培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞中總RNA，用RT-PCR鑒定目的基因HO-1的mRNA的表達(dá)以及用蛋白質(zhì)印跡分析（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞裂解液中HO-1蛋白的表達(dá)兩種方法檢測(cè)plenti-GFP--HO-1在體外條件下能否表達(dá)目的基因和蛋白。
　　結(jié)果：細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因的MSCs與未轉(zhuǎn)基因的MSCs生長(zhǎng)曲線沒(méi)有顯著差別，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PCR檢測(cè)到了HO-1-MSCs組的H

9、O-1mRNA表達(dá)，而MSCs和空載體組HO-1mRNA表達(dá)不明顯。Western Blot檢測(cè)細(xì)胞裂解液中HO-1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：按MOI=20，慢病毒包裝系統(tǒng)可成功將HO-1基因轉(zhuǎn)染MSCs：效率肯定、相對(duì)安全，且對(duì)MSCs的增殖沒(méi)有明顯影響。
　　RT-PCR檢測(cè) HO-1-mRNA以及 Western Blot檢測(cè) HO-1蛋白表達(dá)證明plenti-GFP--HO-1在體外條件下能夠表達(dá)目的基因和蛋白，從而使

10、 plenti-GFP--HO-1應(yīng)用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)成為可能。
　　第三部分 HO-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外缺血缺氧環(huán)境下炎癥和凋亡的影響
　　目的：觀察HO-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外缺血缺氧環(huán)境下炎癥和凋亡的影響。
　　方法：取生長(zhǎng)良好的第2代MSCs接種，培養(yǎng)至生長(zhǎng)匯合70-80%時(shí)，加入慢病毒載體HO-1，設(shè)定轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection, MOI）為20，以只含

11、GFP的空質(zhì)粒進(jìn)行對(duì)照。熒光顯微鏡觀察綠色熒光。提取蛋白后進(jìn)行western blot蛋白鑒定。用 FITC-Annexin V和 PI雙染法行流式細(xì)胞儀分析比較 MSCs，轉(zhuǎn)慢病毒空載體的MSCs和轉(zhuǎn) HO-1的 MSCs三種細(xì)胞通過(guò)血清和氧剝奪方式（serum and oxygen deprivation, SOD）模擬缺血缺氧環(huán)境培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的凋亡和死亡情況。Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、HO-1蛋白表達(dá)。

12、細(xì)胞上清液檢測(cè)炎性因子的水平。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染MSCs48小時(shí)后，可檢測(cè)到強(qiáng)熒光出現(xiàn)。Western blot檢測(cè)表明HO-1蛋白表達(dá)產(chǎn)物的分子量與已知分子量相符合。MSCs在缺氧狀態(tài)下發(fā)生大量凋亡，其凋亡率為62.4%，轉(zhuǎn)空載體的細(xì)胞凋亡率達(dá)68.9%，而轉(zhuǎn)HO-1基因的MSC的凋亡率僅為8.2%。Western blot檢測(cè)表明轉(zhuǎn)HO-1基因的MSCs，HO-1、Bcl-2蛋白表達(dá)增高而B(niǎo)ax表達(dá)降低。Bcl-2/Bax比值升

13、高。上清液檢測(cè)轉(zhuǎn)HO-1基因的MSCs炎性因子TNF-ɑ，IL-6水平降低，IL-10水平升高。
　　結(jié)論：轉(zhuǎn)HO-1的MSCs在體外較MSCs更能耐受缺氧所誘發(fā)的凋亡，其原因與HO-1抗炎、抗氧化、和抑制凋亡有關(guān)。
　　第四部分豬HO-1轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性心肌病的機(jī)制研究
　　目的：探討豬HO-1轉(zhuǎn)染MSCs移植治療缺血性心肌病的療效及機(jī)理。
　　方法：選用15～20㎏梅山小型豬24頭，隨機(jī)分4

14、組：A組：空白組、B組：DMEM組、C組：MSCs組和D組：轉(zhuǎn)基因組，應(yīng)用明膠海綿栓塞LAD建立心梗模型。采用密度梯度離心與貼壁篩選相結(jié)合的方法分離純化、體外擴(kuò)增 MSCs，D組MSCs體外轉(zhuǎn)染 HO-1基因。C組移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用 GFP標(biāo)記。干細(xì)胞（1×107/5 mL）在 DSA下經(jīng)心導(dǎo)管注射到第二對(duì)角支栓塞處末端。于4周后行Powerlab、心臟超聲及心肌核素顯像檢查，評(píng)估心功能。檢測(cè)血漿TGF-β1、VEGF、TNF-ɑ

15、，IL-6，IL-10在移植前后的變化；組織學(xué)觀察各組移植細(xì)胞的情況，TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡情況，測(cè)算心梗面積和梗死區(qū)血管密度。流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞的存活率。
　　結(jié)果：移植前，梗死心臟的左室舒張末徑（EDWT）增加，EF明顯下降，血流動(dòng)力學(xué) LVDP、±dp/dtmax下降明顯。移植后，C、D組的心功能較移植前明顯改善P<0.05）；心肌核素顯像提示梗死區(qū)血流灌注明顯改善（P<0.05），這種改善在D組更為明顯（與C組比較

16、，P<0.05）。與A、B兩組相比，C、D組梗死區(qū)的毛細(xì)血管密度明顯增加（P<0.05），D組的增加比 C組顯著；同樣比較，TGF-β1、TNF-ɑ，IL-6降低明顯（P<0.05），D組的降低比C組顯著。C、D組VEGF、IL-10的水平在治療后明顯增加；D組的增加比C組顯著；心肌細(xì)胞凋亡率和心梗面積C、D組明顯降低（P<0.05），D組的降低比C組顯著；干細(xì)胞的存活率D組較C組明顯增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：HO-1轉(zhuǎn)染