人參皂甙Rd對成年大鼠缺血性腦卒中后血管發(fā)生的機制研究.pdf

1、缺血性腦卒中以其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率成為影響全球健康的首要殺手。腦血流一旦被阻塞超過數(shù)分鐘，神經(jīng)細胞便發(fā)生不可逆的損傷和死亡。人參皂甙（Ginsenoside Rd，GSRd）是從三七、人參中提取的有效單體成分，本課題組前期的實驗顯示GSRd除了可以促進大鼠MCAO后梗死灶周圍的微血管發(fā)生，還可以促進體外培養(yǎng)人臍靜脈微血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vein microvascular endothelial ce

2、lls，HUVECs）的管腔形成，并初步發(fā)現(xiàn)GSRd的作用與Hif-1α的激活相關(guān)。本課題擬應(yīng)用免疫組化、Western blot、人臍靜脈微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)等技術(shù)，分別在體內(nèi)和體外，進一步探討GSRd的促血管發(fā)生作用機制是否與信號通路AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF的序列性激活相關(guān)。
　　實驗一人參皂甙Rd對成年大鼠腦梗死后血管發(fā)生的影響
　　目的：進一步驗證GSRd對成年大鼠腦梗死后血管發(fā)生的影響。
　　方

3、法：160只成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重280~300g，采用MCAO模型，隨機分為4組：Sham+SA組，Sham+GSRd組，MCAO+SA組，MCAO+GSRd組。造模成功6 h后開始腹腔注射GSRd10 mg/kg/d，連續(xù)7 d，MCAO對照組給予同體積生理鹽水，并分別在PSD1、PSD3、PSD7、PSD14和PSD21留取大鼠腦標本行冰凍切片，用 RECA-1單克隆抗體分別標記不同時間點大鼠的微血管，觀察

4、缺血半暗帶區(qū)微血管的密度和分支點的變化。
　　結(jié)果：各Sham組之間微血管密度和分支點無變化（P>0.05，Sham+SA組 vs. Sham+GSRd組）；MCAO+SA組微血管的密度和分支點在PSD1明顯減少（P<0.05），在PSD3、PSD7和PSD14時微血管的密度和分支點呈逐漸上升的趨勢，并且在PSD14達到峰值，PSD21有所下降（MCAO+SA組 vs. Sham組）；MCAO+GSRd組微血管密度和分支點在各時間

5、點的變化趨勢和MCAO+SA組基本一致，但其微血管密度和分支點在每個時間點均高于MCAO+ SA組（P<0.05，MCAO+ GSRd組 vs. MCAO+SA組）。
　　結(jié)論：GSRd可明顯促進大鼠腦梗死后微血管的發(fā)生。
　　實驗二人參皂甙Rd對成年大鼠腦梗死后血管發(fā)生的機制研究
　　目的：探索GSRd促進血管生長因子靶點是否包括Hif-1α的上游因子AKT和mTOR，進而探討GSRd是否通過激活信號通路AKT-mT

6、OR-Hif-1α-VEGF而發(fā)揮促血管發(fā)生的作用。
　　方法：（1）成年雄性SD大鼠隨機分為4組：Sham+SA組，Sham+GSRd組，MCAO+SA組，MCAO+GSRd組。MCAO模型成功后6 h開始腹腔注射給藥GSRd10 mg/kg，連續(xù)給藥3 d。在PSD3，應(yīng)用Western blot檢測半暗帶區(qū)腦組織中的VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表達水平。（2）成年雄性SD大鼠隨機分為3組：MCAO+

7、SA，MCAO+GSRd，MCAO+GSRd+雷帕霉素。造模30 min前腹腔注射雷帕霉素250 ug/kg，后再連續(xù)給藥2 d，MCAO模型成功后6 h腹腔注射GSRd10 mg/kg，連續(xù)3 d后，用Western blot檢測半暗帶區(qū)腦組織中的VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表達變化，觀察雷帕霉素抑制mTOR的激活后，其下游因子表達的情況。（3）成年SD大鼠隨機分為3組：MCAO+SA組，MCAO+GSRd組

8、，MCAO+GSRd+ LY294002組。側(cè)腦室立體定位埋入腦室套管，待大鼠恢復5 d后行MCAO模型，每天經(jīng)腦室套管注射AKT抑制劑LY294002（10 mM，5 ul），腹腔注射GSRd10 mg/kg/d，兩者均連續(xù)3 d，用Western blot檢測半暗帶區(qū)腦組織中VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表達變化。（4）分組同（3），大鼠連續(xù)用LY294002和GSRd，方法同（3），連續(xù)給藥7 d腦組織冰凍

9、切片后，用RECA-1單克隆抗體免疫組化染色，觀察LY294002對大鼠微血管的影響。
　　結(jié)果：（1）在PSD3，Sham組之間VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表達無差別（P>0.05，Sham+SA組 vs. Sham+GSRd組）；MCAO后VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表達均下降（P<0.05，MCAO+SA組 vs. Sham組）；GSRd可明顯促進VEGF、Hif-1α、p-mTO

10、R和p-AKT的表達（P<0.05，MCAO+GSRd組 vs. MCAO+SA組）。（2）在加入mTOR特異性阻斷劑雷帕霉素后，mTOR的活化形式p-mTOR以及其下游Hif-1α和VEGF的表達均明顯降低（P<0.05），而其上游p-AKT的表達不受影響（P>0.05，MCAO+GSRd+雷帕霉素組 vs. MCAO+GSRd組）。（3）在加入AKT抑制劑LY294002后，p-AKT、p-mTOR、Hif-1α和VEGF的表達均明

11、顯降低（P<0.05，MCAO+GSRd+LY294002組 vs. MCAO+GSRd組）；（4）LY294002可明顯減少半暗帶區(qū)微血管密度（P<0.01，MCAO+GSRd+LY294002組 vs. MCAO+GSRd組=426.56±48.38 vs.532.03±16.17），同時減少分支點（P<0.01，MCAO+GSRd+LY294002組 vs. MCAO+GSRd組=212.50±24.32 vs.330.47±20

12、.44）。
　　結(jié)論：在體內(nèi)，GSRd促進血管發(fā)生的作用可能與AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF信號通路激活相關(guān)。
　　實驗三人參皂甙Rd對體外培養(yǎng)人臍靜脈微血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）的作用
　　目的：在體外培養(yǎng)的HUVECs中探討GSRd是否通過AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF的激活而發(fā)揮促血管發(fā)生的作用。
　　方法：（1）模型的建立。采用氧糖剝奪/再灌注損傷模型（oxygen-glucose

13、deprivation/reperfusion, OGD）。體外培養(yǎng)HUVECs，實驗分為5組：正常培養(yǎng)組、OGD組、OGD+GSRd1 uM組、5 uM組、10 uM組。正常培養(yǎng)的HUVECs氧糖剝奪8 h，復氧12 h后，吸取上清20 ul檢測LDH釋放量，向貼壁細胞的96孔板中加入CCK-8試劑測定細胞活性，貼壁細胞經(jīng)消化后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。（2）GSRd作用機制的探索。實驗分為6組：正常組、OGD組、OGD+GSRd1

14、 uM組、OGD+GSRd1 uM+2-ME2組、OGD+GSRd1 uM+雷帕霉素組、OGD+GSRd1 uM+LY294002組。OGD8 h復氧12 h后，分別提取細胞總蛋白或核蛋白，通過Western blot檢測VEGF、p-mTOR、p-AKT或Hif-1α的表達。
　　結(jié)果：（1）OGD后細胞存活明顯減少，細胞毒性和細胞凋亡明顯增加（P<0.05，OGD組 vs.正常培養(yǎng)組）；1 uM和5 uM的GSRd干預(yù)后細胞存

15、活均明顯提高，毒性顯著降低，凋亡明顯減少（P<0.05，GSRd1或5 uM組 vs. OGD組），5 uM組和1 uM組之間無差別（P>0.05），而10 uM的GSRd干預(yù)后細胞存活卻明顯降低、凋亡比例顯著上升（P<0.05，OGD+GSRd10 uM vs. OGD+GSRd1 uM）。（2）正常培養(yǎng)的細胞可表達VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT，OGD后VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表達均明顯降

16、低（P<0.05，OGD組 vs.正常培養(yǎng)組）；1 uM GSRd干預(yù)后上述因子的表達明顯增高（P<0.05，GSRd1 uM組 vs. OGD組）；分別加入Hif-1α抑制劑2-ME2、mTOR抑制劑雷帕霉素和AKT抑制劑LY294002后，Hif-1α和VEGF的表達均被明顯抑制（P<0.05，OGD+GSRd+抑制劑組 vs. OGD+GSRd組），雷帕霉素可顯著抑制 p-mTOR的表達但不能抑制其上游信號通路中 p-AKT的表達