鯉皰疹病毒3型囊膜蛋白ORF136、ORF25的篩選和鑒定.pdf

1、鯉皰疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus3,CyHV-3），又稱為錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus,KHV），是引起鯉魚、錦鯉及其變種高度傳染性錦鯉皰疹病毒病（Koi herpesvirus disease,KHVD）的病原。KHVD自1997年首次報(bào)道以來(lái)，在全球多個(gè)國(guó)家傳播、流行，范圍覆蓋亞洲、歐洲、北美及非洲多個(gè)國(guó)家地區(qū)，給鯉魚及錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成無(wú)可估量的經(jīng)濟(jì)損失。CyHV-3隸屬于皰疹病毒目，異皰疹病毒

2、科，鯉皰疹病毒屬，是具有囊膜包裹的雙鏈DNA病毒。病毒的囊膜蛋白在識(shí)別宿主細(xì)胞受體介導(dǎo)病毒入侵等方面具有關(guān)鍵性的作用，而關(guān)于CyHV-3囊膜蛋白的研究卻非常有限。本論文將對(duì)CyHV-3純化病毒粒子和囊膜組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，篩選病毒可能存在的囊膜蛋白，在此基礎(chǔ)上對(duì)推測(cè)的囊膜蛋白ORF136和ORF25進(jìn)行定位研究，試驗(yàn)證實(shí)ORF136和ORF25為CyHV-3的囊膜蛋白，為后續(xù)的蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。全文內(nèi)容分為以下三個(gè)部分：
　

3、　1、CyHV-3增殖與純化：分別將CyHV-3 GZ1301分離株和E分離株感染敏感細(xì)胞系鯉魚腦細(xì)胞（Common carp brain,CCB），進(jìn)行病毒大量增殖，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic Effect，CPE）后收集病毒懸液。采用20％~66%蔗糖密度梯度超速離心方法對(duì)病毒懸液進(jìn)行純化。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，66%密度蔗糖收集到大量病毒粒子，幾乎不含細(xì)胞雜質(zhì)，完整的病毒顆粒直徑為150~200 nm，與之前的

4、報(bào)道一致。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）與考馬斯亮藍(lán)染色法顯示純化的病毒可看到清晰的蛋白條帶。利用1%的非離子去垢劑TritonX-100對(duì)病毒顆粒進(jìn)行處理，收集囊膜成分和核衣殼成分，透射電鏡觀察、SDS-PAGE電泳和免疫印跡分析均表明，該方法可有效用于病毒囊膜和核衣殼的分離。
　　2、CyHV-3蛋白質(zhì)組分析：將純化的CyHV-3病毒顆粒和分離的病毒囊膜組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色脫色后

5、，割膠胰酶消化，進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析（Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS），用MASCOT檢索uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。分析顯示兩株不同分離株純化的病毒顆粒一共鑒定到46個(gè)蛋白，包括14個(gè)囊膜蛋白、4個(gè)衣殼蛋白、2個(gè)皮層蛋白和26個(gè)未知蛋白，除了與之前報(bào)道的共有蛋白之外，還新鑒定了4個(gè)蛋白，分別是ORF82、ORF88、ORF121和ORF139；囊膜組分一共鑒

6、定到16個(gè)蛋白。綜合結(jié)果表明CyHV-3至少存在46個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包括22個(gè)囊膜蛋白、4個(gè)衣殼蛋白、2個(gè)皮層蛋白和18個(gè)未知蛋白。基于鯉魚全基因組數(shù)據(jù)的蛋白鑒定一共檢測(cè)到22個(gè)CyHV-3相關(guān)的宿主蛋白，涉及壓力應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等功能。
　　3、ORF136和ORF25蛋白鑒定：在上一部分囊膜蛋白篩選的基礎(chǔ)上，我們對(duì)囊膜蛋白ORF136和ORF25進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。首先對(duì)ORF136基因編碼蛋白氨基酸序列預(yù)測(cè)抗原性片段進(jìn)行PCR

7、擴(kuò)增，并與原核載體pET-32a(+)連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將純化后的重組蛋白免疫兔子制備多克隆抗體，運(yùn)用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行鑒定。另外，對(duì)ORF136進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，與真核表達(dá)載體pVAX1連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pVAX1-ORF136。利用制備的ORF136多克隆抗體對(duì)ORF136蛋白進(jìn)行免疫印跡、免疫熒光和免疫電鏡定位。免疫印跡分析結(jié)果表明，純化的病毒顆粒和分離

8、的囊膜均能檢測(cè)到特異的蛋白條帶，大小與預(yù)測(cè)一致，約為15 KDa，表明ORF136蛋白為囊膜蛋白；激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，感染CyHV-3的CCB細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pVAX1-ORF136的CCB細(xì)胞，均在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，表明該蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)。免疫電鏡技術(shù)進(jìn)一步證明了ORF136定位在CyHV-3的囊膜上。
　　同樣，利用特異性的ORF25多克隆抗體對(duì)ORF25蛋白進(jìn)行免疫印跡和間接免疫熒光分析。免疫印跡分析結(jié)果表

9、明純化的病毒顆粒和分離的囊膜在100~130 KDa處均能檢測(cè)到特異的蛋白條帶，雖然大小與預(yù)測(cè)的65 KDa不一致，但可以表明該蛋白定位在囊膜上。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，在感染CyHV-3的CCB細(xì)胞和轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)載體pcDNA33-ORF25的CCB細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，表明該蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)。
　　本文對(duì)純化的CyHV-3病毒顆粒和囊膜組分進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析，并運(yùn)用免疫印跡、免疫熒光和/或免疫電鏡等技術(shù)對(duì)囊