中華絨螯蟹螺原體抗原膜蛋白篩選及其ORF0313蛋白毒力功能研究.pdf

1、索取號(hào)：S91／4140：141202126南京師勉太掌碩士學(xué)位論文胤鰳中華絨螯蟹螺原體抗原膜蛋白篩選及其0RF0313蛋白毒力功能研究，研究生：指導(dǎo)教師：培養(yǎng)單位：一級(jí)學(xué)科：二級(jí)學(xué)科：完成時(shí)間：答辯時(shí)間：。王健王文生命科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖2017年3月12日2017年5月19日㈣3㈣9哪2㈣2Ⅲj1㈣33ⅢY摘要摘要中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是一種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。伴隨養(yǎng)殖集約化程度的提高，由細(xì)菌

2、等病原微生物引發(fā)的疾病越來越頻繁，阻礙了中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。在中華絨螯蟹感染的疾病中，顫抖病是危害最為嚴(yán)重的病害之一。本課題組已證實(shí)中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasmaeriocheiris)是引發(fā)顫抖病的病原體，并已完成很多Seriocheiris相關(guān)的研究，如病原檢測(cè)、基因組測(cè)序、治療藥物篩選等，但是關(guān)于&eriocheir&膜上與致病相關(guān)蛋白的研究還很少。為此，本碩士論文在基因組學(xué)、免疫蛋白組學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了螺

3、原體膜蛋白免疫蛋白組學(xué)分析，從篩選出的抗原膜蛋白中選取ORF0313蛋白做了基因克隆、蛋白表達(dá)、毒性等研究。本論文為探明中華絨螯蟹螺原體侵染宿主機(jī)理以及為更好預(yù)防該病原對(duì)宿主侵染提供理論基礎(chǔ)。論文包括以下三個(gè)部分：1免疫蛋白組學(xué)方法篩選膜蛋白中的抗原蛋白本實(shí)驗(yàn)利用免疫沉淀方法，將等量中華絨螯蟹螺原體膜蛋白分別與陽性、陰性血清結(jié)合，分別篩選出蛋白32個(gè)和6個(gè)，其中2個(gè)相同，最終篩選出30個(gè)抗原膜蛋白，其中22個(gè)已知蛋白、8個(gè)假定蛋白。22

4、個(gè)已知蛋白包括已證實(shí)的外膜蛋白：丙酮酸激酶、烯醇酶、3磷酸甘油醛脫氫酶、丙酮酸脫氫酶E2和DnaK，這些蛋白在病原侵染宿主細(xì)胞過程中扮演著重要的角色。2ORF0313蛋白生物信息學(xué)分析、基因克隆、點(diǎn)突變及蛋白原核表達(dá)利用生物信息學(xué)方法對(duì)ORF0313蛋白進(jìn)行了信號(hào)肽、跨膜螺旋區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示該蛋白可能為螺原體分泌蛋白或膜蛋白。為了對(duì)該蛋白的功能做進(jìn)一步研究，根據(jù)中華絨螯蟹螺原體全基因組序列，克隆出了ORF0313基因序列，長(zhǎng)度

5、為1091bp，生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)得到：ORF0313蛋白理論分子量約為40kDa，等電點(diǎn)為49。然后將ORF0313基因連接克隆載體pSIMPLE19，并利用試劑盒進(jìn)行了點(diǎn)突變，將TGA變成TGG，將突變成功的ORF0313進(jìn)行雙酶切，并與pET28a表達(dá)載體連接，構(gòu)建成pETORF0313載體導(dǎo)入表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞(BL21)中，進(jìn)行原核表達(dá)，并利用Ni柱進(jìn)行蛋白純化。3ORF0313蛋白抗體制備、細(xì)胞定位及毒性實(shí)驗(yàn)將純化后的ORF03