中華絨螯蟹螺原體侵染羅氏沼蝦血細(xì)胞過程中互作蛋白的篩選及功能研究.pdf

1、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)又稱馬來西亞大蝦、淡水長臂大蝦，是世界上個體最大的淡水蝦之一，同時也是目前國內(nèi)主要的三大淡水經(jīng)濟(jì)蝦類之一。自1976年引入中國以來，該品種在國內(nèi)的養(yǎng)殖面積逐年擴(kuò)大、產(chǎn)量逐年增加。然而，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大及集約化程度的提高，一些由細(xì)菌、病毒等引起的病害日趨嚴(yán)重，其中還包括新型病原——中華絨螯蟹螺原體。前期研究表明，中華絨螯蟹螺原體通過鰓或體表進(jìn)入河蟹體內(nèi)，侵染其靶細(xì)胞——

2、小顆粒血細(xì)胞，在血細(xì)胞中大量繁殖，然后通過血細(xì)胞的流通將病原帶到機(jī)體各器官的結(jié)締組織中，并侵染到神經(jīng)和肌肉組織，造成病蟹感染前期的無力不食和感染后期的附肢顫抖等病癥。但作為一種沒有細(xì)胞壁的特殊細(xì)菌病原是如何黏附、侵染宿主靶細(xì)胞?在病原與宿主博弈過程中有哪些關(guān)鍵的蛋白相互作用？
　　本博士學(xué)位論文在前期研究的基礎(chǔ)上，首先通過相對和絕對定量同位素標(biāo)記(isobaric tags forrelative and absolute qua

3、ntitation，iTRAQ)技術(shù)，篩選螺原體感染7天后羅氏沼蝦血細(xì)胞中的差異蛋白，通過蛋白質(zhì)組學(xué)來分析螺原體可能的感染機(jī)制以及宿主的防御機(jī)理。其次，利用Far-western印記技術(shù)篩選羅氏沼蝦血細(xì)胞的候選受體蛋白，體外細(xì)菌結(jié)合及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)對所得到的受體蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，通過合成特異性雙鏈RNA，在羅氏沼蝦個體水平研究受體基因功能。最后，利用Far-western印記技術(shù)篩選對應(yīng)螺原體的配體蛋白，體外培養(yǎng)羅氏沼蝦血細(xì)胞，在細(xì)胞水平通

4、過競爭性實(shí)驗(yàn)對配體蛋白功能進(jìn)行研究。本論文為螺原體侵染機(jī)理及宿主免疫防御機(jī)制的深入研究奠定了良好的基礎(chǔ)，本文研究結(jié)果主要包括以下6個方面:
　　1.iTRAQ篩選螺原體感染前后羅氏沼蝦血細(xì)胞的差異蛋白
　　本實(shí)驗(yàn)通過iTRAQ的研究，動態(tài)、整體、定量地觀察螺原體感染前后羅氏沼蝦血細(xì)胞蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變。篩選羅氏沼蝦血細(xì)胞經(jīng)過螺原體感染后的差異蛋白譜，初步鑒定出具有明確功能的蛋白與結(jié)合、催化、結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)等分子功能有關(guān)。本實(shí)

5、驗(yàn)選擇差異倍數(shù)大于等于1.5的蛋白進(jìn)行功能分析，實(shí)驗(yàn)中篩選出69個具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異顯著蛋白質(zhì)。上調(diào)蛋白中，包括6個免疫相關(guān)蛋白，14個生理性蛋白，25個胞內(nèi)蛋白，4個未知/假設(shè)蛋白。下調(diào)蛋白中，包括4個免疫相關(guān)蛋白，3個骨架蛋白，11個生理性蛋白，2個未知/假設(shè)蛋白。選擇其中7個蛋白，通過qRT-PCR檢測對應(yīng)mRNA水平的表達(dá)變化，結(jié)果表明基本與iTRAQ篩選結(jié)果保持一致。
　　2.Far-western印跡篩選羅氏沼蝦受體

6、蛋白
　　羅氏沼蝦血細(xì)胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以甲醛固定過的螺原體為覆蓋蛋白，然后依次孵育抗螺原體的兔多抗和抗兔的熒光標(biāo)記二抗。綜合Far-western結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)初步從羅氏沼蝦血細(xì)胞總蛋白中釣取了6種可能與S.eriocheiris相互作用的受體蛋白。根據(jù)分子功能，將受體蛋白分為三大類:細(xì)胞骨架、先天性免疫系統(tǒng)、信號傳導(dǎo)因子。細(xì)胞骨架，包括Beta-Actin、Beta-Tubulin及Alpha-T

7、ubulin蛋白。先天性免疫系統(tǒng)，包括LGBP和proPO蛋白。信號傳導(dǎo)因子，包括Ran蛋白。
　　3.Beta-Actin蛋白原核表達(dá)及受體功能驗(yàn)證
　　在此部分實(shí)驗(yàn)中，以Beta-Actin為研究對象通過細(xì)菌結(jié)合及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其作為受體蛋白的可靠性。體外細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)，將純化的Beta-Actin重組蛋白與螺原體室溫結(jié)合2h，然后PBS多次洗脫，最后用8M脲強(qiáng)力洗脫，結(jié)果Beta-Actin依然可以結(jié)合在螺原體的表

8、面。激光共聚焦結(jié)果顯示綠色熒光標(biāo)記的螺原體貼附在紅色熒光的Actin蛋白上，兩者相互疊加產(chǎn)生黃色熒光，進(jìn)一步從細(xì)胞水平證實(shí)Beta-Actin與螺原體存在相互作用。
　　4.LGBP蛋白原核表達(dá)及受體功能研究
　　LGBP通常都能夠識別并結(jié)合脂多糖及β-1，3-葡聚糖，從而參與革蘭氏陰性菌和真菌的識別及防御，但是LGBP對于缺乏細(xì)胞壁細(xì)菌的識別還尚未有過報(bào)道。本研究首先重組表達(dá)并純化LGBP蛋白，體外細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)LGBP

9、蛋白能夠與螺原體相結(jié)合。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)，采用抗LGBP鼠多抗和Alexa Fluor555標(biāo)記驢抗小鼠二抗來特異性的標(biāo)記羅氏沼蝦血細(xì)胞的LGBP蛋白，結(jié)果顯示綠色熒光標(biāo)記的螺原體貼附在紅色熒光的LGBP蛋白上。接下來，合成LGBP特異性雙鏈RNA，觀察LGBP基因干擾對于螺原體拷貝數(shù)和羅氏沼蝦存活率的影響。結(jié)果表明，螺原體感染后第3天，LGBP dsRNA注射組的羅氏沼蝦血細(xì)胞中螺原體拷貝數(shù)明顯少于GFP dsRNA和PBS注射組。羅氏

10、沼蝦存活率統(tǒng)計(jì)顯示，LGBP基因的沉默增加了宿主對螺原體侵染的敏感性，死亡率要高于兩個對照組。以上結(jié)果表明，LGBP作為胞外受體蛋白參與了螺原體黏附細(xì)胞的過程，但是除了LGBP之外應(yīng)該還有其他的受體蛋白。
　　5.Ran基因克隆、蛋白原核表達(dá)及功能研究
　　前期研究表明，對蝦和果蠅小G蛋白Ran參與了病毒吞噬過程。本研究進(jìn)一步探討Ran介導(dǎo)螺原體的吞噬作用，揭示Ran調(diào)控細(xì)胞吞噬的分子機(jī)制。首先，利用質(zhì)譜所得肽段序列設(shè)計(jì)簡并

11、引物擴(kuò)增Ran基因的中間序列，并通過RACE技術(shù)擴(kuò)增得到基因全長。然后，通過體外細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ran蛋白能夠與螺原體相結(jié)合。最后，合成Ran特異性雙鏈RNA，觀察Ran基因干擾對于螺原體拷貝數(shù)和羅氏沼蝦存活率的影響。結(jié)果表明MrRan-dsRNA注射組中螺原體拷貝數(shù)明顯少于對照組，該組中羅氏沼蝦存活率也要高于兩個對照組。推測羅氏沼蝦Ran蛋白作為胞內(nèi)受體蛋白參與了S.eriocheiris的吞噬過程，MrRan可能參與了吞噬作用中異物

12、攝入過程。
　　6.Far-western印記篩選螺原體配體蛋白及配體蛋白功能驗(yàn)研究
　　通過Far Western印記篩選Beta-Actin及LGBP的配體蛋白，Beta-Actin的候選配體蛋白為轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)，LGBP蛋白的候選配體蛋白分別為烯醇酶（enolase）、轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase)和RNA聚合酶β亞基(