人皰疹病毒6型101K被膜蛋白表達(dá)克隆的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、目的 構(gòu)建人皰疹病毒6型(HHV-6)101K被膜蛋白的原核高效表達(dá)克隆,制備用于活動(dòng)性HHV-6感染血清學(xué)診斷的基因工程抗原.方法 應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從臨床唾液標(biāo)本分離HHV-6毒株,出現(xiàn)細(xì)胞病變者用HHV-6特異性引物及限制性酶切分析法進(jìn)行初步鑒定;PCR擴(kuò)增HHV-6B 101K被膜蛋白主要抗原決定簇區(qū)(666~834aa)編碼基因片段(nt2347~2853),并導(dǎo)入T載體進(jìn)行測(cè)序,與Genebank標(biāo)準(zhǔn)毒株序列比較以進(jìn)一步鑒定.

2、目的基因及表達(dá)載體pThioHis A分別經(jīng)雙酶切后連接,轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳-敖合物瓊脂糖樹脂柱親和層析初步純化,以Western-Blot鑒定其抗原性和特異性.用純化重組蛋白包被ELISA反應(yīng)板,檢測(cè)197份血清中HHV-6 IgM抗體,與間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較,同時(shí)檢測(cè)15份HCMV陽性血清,以分析重組蛋白的特異性.結(jié)果 PCR擴(kuò)增獲得的目的基因序列與Geneban

3、k中HHV-6B標(biāo)準(zhǔn)毒株Z29序列一致.HHV-6 101K融合蛋白可在E.coli BL21中有效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物為硫氧還(HP-thioredoxin)融合蛋白,純化后獲得單一目的蛋白條帶.West-ern-blot檢測(cè)結(jié)果表明該融合蛋白可與12份HHV-6 IgM陽性血清中的10份(83.3％)發(fā)生反應(yīng),而與8份陰性血清均不發(fā)生反應(yīng).用該融合蛋白包被ELISA反應(yīng)板,檢測(cè)197份血清中HHV-6 IgM抗體,與IFA檢測(cè)血清IgM抗