黃河鯉LGP2和STING基因的鑒定及其遺傳多態(tài)性與鯉皰疹病毒感染的篩選.pdf

1、豫選黃河鯉（Cyprinus carpio haematopterus）是由河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院采用野生黃河鯉做親本，經(jīng)過近20年、連續(xù)8代精心繁育而成。迄今己得到廣泛推廣，有著顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。然而，近幾年，黃河鯉各類疾病的頻發(fā)，使黃河鯉養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)大大增大，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，明顯制約了該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。感染錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）的黃河鯉具高度傳染性和極高的致死率。直到目前仍沒有好的防御措施和治

2、愈手段。因而了解黃河鯉自身免疫系統(tǒng)對(duì)這種病毒的防御功能和培育抗病的優(yōu)良品種顯得尤為重要，也是維持健康水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)鍵所在。
　　先天免疫識(shí)別受體及信號(hào)通路相關(guān)基因在病毒檢測、干擾素誘導(dǎo)、保護(hù)機(jī)體免受侵害等方面具有關(guān)鍵作用。LGP2作為RIG-I樣模式識(shí)別受體的家族成員之一，首先識(shí)別存在于細(xì)胞質(zhì)中的病毒DNA或RNA，隨后下游系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和促炎性因子。干擾素基因的刺激基因STING是宿主細(xì)胞中DNA病毒

3、識(shí)別的感知器，通過RIG-TBK1-IRF3/IRF7信號(hào)級(jí)聯(lián)來誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，對(duì)DNA病原體做出先天免疫反應(yīng)。
　　為研究上述免疫相關(guān)基因的分子特性和抗病毒機(jī)制，本研究通過基因克隆及病毒感染，鑒定和分析了LGP2、STING基因和KHV病毒體內(nèi)外感染后基因表達(dá)譜以及poly(I∶C)和poly(dA∶dT)配體刺激CFC（尾鰭細(xì)胞）后的基因表達(dá)情況，探究LGP2和STING在病毒識(shí)別及抗病毒級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用。為進(jìn)一步探究LGP2

4、和STING基因與抗KHV的關(guān)聯(lián)性及遺傳特性，本研究提取感染KHV病毒的黃河鯉脾臟的DNA，利用特異PCR和染色體步移技術(shù)獲得LGP2和STING基因全長及5'側(cè)翼序列，并應(yīng)用生物信息學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)軟件SPSS等工具對(duì)克隆所得目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)特征及遺傳信息進(jìn)行系統(tǒng)的比較分析;通過構(gòu)建表達(dá)載體，驗(yàn)證啟動(dòng)子活性;以及利用基因池混合測序和PCR-RFLP方法，對(duì)目的基因的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與黃河鯉抗KHV感染進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并對(duì)其表型關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。

5、
　　1.黃河鯉LGP2基因存在兩個(gè)選擇性剪接體，LGP2a cDNA全長為3061bp，ORF開放閱讀框位于第127位到第2066位核苷酸，編碼680個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測分子量為77，341.2Da，等電點(diǎn)為6.53。預(yù)測四個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括細(xì)菌Ⅲ型限制性內(nèi)切酶的保守結(jié)構(gòu)域，DEAD/DEAH盒解旋酶結(jié)構(gòu)域，C末端解旋酶超家族結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。LGP2b的全長為1928bp，編碼346個(gè)氨基酸，5'-非翻譯區(qū)(UTR)為11

6、4個(gè)核苷酸，3'UTR有603個(gè)核苷酸，其中包括AATAA終止信號(hào)。黃河鯉LGP2基因全長DNA為7655bp，有12個(gè)外顯子，11個(gè)內(nèi)含子，所有內(nèi)含子均是由GT開頭，AG結(jié)尾的，在LGP2 DNA全長與LGP2a和LGP2bmRNA比對(duì)結(jié)果顯示，LGP2a和LGP2b來源于同一條DNA序列，在第七外顯子處mRNA序列出現(xiàn)不同的選擇性剪切，將第七內(nèi)含子的部分序列轉(zhuǎn)錄為第七外顯子，形成一條完整的mRNA序列。LGP2的5'側(cè)翼序列預(yù)測有兩

7、個(gè)啟動(dòng)子，并且其活性均能被KHV誘導(dǎo)加強(qiáng)。病毒感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LGP2有助于dsDNA病毒介導(dǎo)的細(xì)胞先天免疫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)。
　　2.LGP2的16個(gè)有效的多態(tài)位點(diǎn)被探測到:其中包括12個(gè)SNP位點(diǎn)、4個(gè)有缺失核苷酸的位點(diǎn);其中5'側(cè)翼區(qū)的-294GCT三核苷酸缺失和414 GT二核苷酸缺失位點(diǎn)以及內(nèi)含子中的3820 T/C和3836T/G位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在抗性組和易感組間差異顯著。經(jīng)二次感染驗(yàn)證表明，-294 ins、

8、414 ins、3820TT，3836TT基因型的黃河鯉分別比-294 del、414del，3820CC，3836GG型的黃河鯉死亡率低。因此該四個(gè)位點(diǎn)的突變可能是黃河鯉皰疹病毒病的遺傳相關(guān)的危險(xiǎn)因素。
　　3.STING cDNA全長1528bp，編碼402個(gè)氨基酸的多肽，分子量為46.184kDa，等電子點(diǎn)為6.08。推測的STING蛋白含有信號(hào)肽，N-末端區(qū)域中的三個(gè)跨膜基序和駐留的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白中發(fā)現(xiàn)存在四個(gè)假定基序(RXR

9、)。STING基因DNA全長為8068bp，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，所有內(nèi)含子均遵循GT開頭，AG結(jié)尾的規(guī)律。5'-側(cè)翼序列為901bp，序列預(yù)測有啟動(dòng)子活性，其活性可被KHV誘導(dǎo)加強(qiáng)。STING被鑒定為由DNA病原體介導(dǎo)的黃河鯉先天免疫應(yīng)答的組成部分，并且在體外和體內(nèi)都證實(shí)了STING對(duì)下游反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。
　　4.STING的14個(gè)有效的多態(tài)位點(diǎn)被探測到:13個(gè)SNP位點(diǎn)、1個(gè)有缺失核苷酸的位點(diǎn);其中5'側(cè)翼

10、區(qū)的-873G/C和-687CCT三核苷酸缺失位點(diǎn);外顯子中的6767G/A和7034C/T位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在抗性組和易感組間差異顯著。二次病毒刺激實(shí)驗(yàn)表明，STING基因的-873GG、-687ins、6767GG和7034CC基因型的黃河鯉分別比-873CC、-687del、6767TT和7034TT型的黃河鯉死亡率低(P＜0.05)，可以認(rèn)為-873G/C、-687ins/del、6767G/A和7034C/T與黃河鯉抗

11、KHV感染抗性-易感表型顯著相關(guān)，可以作為抗病育種的分子標(biāo)記。
　　5.為了研究黃河鯉對(duì)KHV病毒的抗病防御機(jī)制和抗KHV的關(guān)聯(lián)性，本研究將KHV病毒感染后黃河鯉抗性組和易感組的鰓和脾臟的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，4個(gè)組織轉(zhuǎn)錄組測序共獲得1.90億個(gè)Raw reads，過濾后得到1.35億Clean reads，經(jīng)Trinity軟件組裝后，得到469，251個(gè)transcripts和366，783個(gè)unigene，unigene平均長

12、度667，最長為18437bp，最短為201bp。其中長度在200-600 bp的序列有347659條，占74.08％。比對(duì)到Nr數(shù)據(jù)庫的序列有31，837條，且與斑馬魚一致性最高，其次是墨西哥麗脂鯉和虹鱒，說明與鯉科魚類的基因一致性最高。采用R with edgeR package篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析，脾臟和鰓的抗性和易感組的差異基因數(shù)量相似，從天然免疫識(shí)別受體途徑中選出78個(gè)基因在抗性組和

13、易感組之間的表達(dá)差異表明，魚類在脾中和鰓中抗KHV病毒的反應(yīng)是不同的。
　　本研究還對(duì)轉(zhuǎn)錄組文庫中的基因進(jìn)行SNP、SSR和選擇性剪切進(jìn)行概況分析。無論是鰓還是脾抗病組的SNP位點(diǎn)少于易感組;編碼區(qū)SNP位點(diǎn)少于非編碼區(qū)，但脾臟中編碼區(qū)突變多于非編碼區(qū);每個(gè)組織轉(zhuǎn)錄組中，有意突變占總SNP的43.1％-50.58％，而無意突變僅占0.11％-0.13％。文庫中由C轉(zhuǎn)換為T的SNP最多，其次是由T轉(zhuǎn)換為C，最少的是由C轉(zhuǎn)換為G。本數(shù)

14、據(jù)庫中從檢測序列168，510條中檢測出31，084條存在SSR，而包含SSR的序列數(shù)為25，240，約占總檢測序列數(shù)的15％，包含多于一個(gè)SSR的序列為4，549條，占所有SSR序列的18％;不同堿基SSR為1，401，含一個(gè)以上SSR的序列約占30.8％。重復(fù)的最大和最小長度分別為119和18，平均長度為24個(gè)核苷酸。SSR的模序類型主要以單核苷酸9-12重復(fù)最多，而4核苷酸及5核苷酸5-8重復(fù)最少。在本研究中，經(jīng)transcrip