牡蠣皰疹病毒感染魁蚶轉(zhuǎn)錄組測(cè)定及免疫相關(guān)基因分析.pdf

1、魁蚶（Scapharca broughtonii）又稱大毛蛤、赤貝、血貝，隸屬軟體動(dòng)物門(mén)、瓣鰓綱、翼足亞綱、蚶目、蚶科、毛蚶屬。主要分布于西太平洋日本、韓國(guó)、中國(guó)沿海及俄羅斯東南部沿海。在中國(guó)，北起鴨綠江，南至廣西均有分布，其中以遼寧、山東資源最為豐富。多棲息在3~50米水深處，是一種營(yíng)埋棲生活的冷水性大型雙殼貝類?？朗且环N優(yōu)質(zhì)的高蛋白、低脂肪食品，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，味道鮮美，具有良好的市場(chǎng)前景和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。但隨著增養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，

2、其病害問(wèn)題日益顯著。2012年、2013年大連、山東多處育苗場(chǎng)暴發(fā)魁蚶種貝大規(guī)模死亡事件，本實(shí)驗(yàn)室從患病魁蚶體內(nèi)分離出一種球形病毒，通過(guò)測(cè)序比對(duì)，證明其為牡蠣皰疹病毒(OsHV-1)。
　　本研究使用患病魁蚶組織制成病毒懸液進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。感染實(shí)驗(yàn)分為空白組，陰性懸液注射組和病毒懸液注射組，并使用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)感染后魁蚶體內(nèi)病毒的時(shí)空分布進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組和陰性懸液組魁蚶感染后未檢測(cè)到病毒粒子，病毒懸液注射組魁蚶經(jīng)人

3、工感染后，各部位組織中病毒含量都呈先上升再下降隨后又上升的趨勢(shì)，最終達(dá)到106拷貝/ng DNA左右。通過(guò)電鏡觀察，在感染魁蚶的鰓、肝胰腺、外套膜中出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)邊緣化甚至消失，細(xì)胞核腫脹、溶解，核仁消失，核膜擴(kuò)張、不清晰，線粒體腫大，脊崩解，核糖體脫落等一系列細(xì)胞病理變化。在其細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均能發(fā)現(xiàn)大量直徑為90~110nm球形病毒粒子，該病毒粒子具囊膜，囊膜內(nèi)可見(jiàn)均勻的高電子密度的核衣殼，與自然患病魁蚶負(fù)染電鏡中的病毒粒子形態(tài)相

4、同。研究結(jié)果表明，OsHV-1可以感染魁蚶并與魁蚶大規(guī)模死亡有直接相關(guān)關(guān)系。目前針對(duì)該病毒的致病性、流行規(guī)律已經(jīng)開(kāi)展了相關(guān)研究，但是對(duì)于該病毒與魁蚶宿主間的相互作用機(jī)制的了解還很有限。本研究分別利用第三代測(cè)序技術(shù) PacBio RSII平臺(tái)和第二代測(cè)序技術(shù)Illumina MiSeq平臺(tái)構(gòu)建魁蚶轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。三代測(cè)序數(shù)據(jù)采用SMRT-Analysis Pipeline對(duì)所得序列進(jìn)行分析，質(zhì)控后共獲得85,127條reads，其中有46,2

5、65條全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)錄本，全長(zhǎng)read平均讀長(zhǎng)為51,903bp。以魁蚶三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝結(jié)果為參考序列，采用Trinity v2.1對(duì)所得序列進(jìn)行de novo拼接，共獲得unigenes（>200bp）276,997條，N50長(zhǎng)度為1.35kb，平均長(zhǎng)度508bp。對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行注釋，共74,529條序列獲得GO號(hào)。用二代測(cè)序結(jié)果對(duì)魁蚶轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，獲得差異基因2998個(gè)，上調(diào)基因933個(gè)，下調(diào)基因2065個(gè)，篩選得到