牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白gD單抗制備及其抗原表位鑒定與雙抗夾心ELISA的建立.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。牛是主要宿主及傳染源。IBRV組織嗜性廣，可引起包括牛的鼻氣管炎、膿性陰道炎、包皮龜頭炎、流產、不孕不育癥、結膜炎、腦炎等多種臨床癥狀。病毒易于三叉神經節(jié)建立潛伏感染，造成病毒的持續(xù)存在并大量排毒，使得IBRV感染難以清除。急性IBRV呼吸道感染引起的牛繼發(fā)性細菌性肺炎，

2、是造成養(yǎng)牛業(yè)經濟損失的重要原因之一。該病于上世紀50年代在美國首次發(fā)現，現呈世界范圍分布。血清學調查表明，我國大部分地區(qū)存在IBRV感染。gD蛋白是IBRV主要囊膜糖蛋白之一，在病毒的吸附及入侵過程中具有重要作用，能夠誘導中和抗體的產生。目前，國內尚無標準化的IBRV檢測方法，國外的檢測試劑盒價格昂貴，因此，有必要開展相關檢測技術方面的研究。
　　本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)的gD蛋白進行了原核表達

3、，免疫印跡試驗表明其免疫原性良好。用超離純化的IBRV免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，重組gD蛋白進行加強免疫，經常規(guī)細胞融合，獲得了13株單克隆抗體(MAb)，其中4株(2D8、3F9、1G3、5B7)可與重組gD蛋白和IBRV全病毒反應，其余9株(2E4、3C2、4E8、1F5、4H5、6B6、3F3、2A9、4D11)僅與IBRV全病毒反應，不與重組gD蛋白反應。單抗1G3具有病毒中和活性，中和效價為1∶32。免疫印跡及間接免疫熒

4、光試驗表明這13株單抗具有良好的反應性。特異性試驗表明這13株單抗只與IBRV反應，不與牛腺病毒3型(BAV-3)及牛副流感病毒3型(BPIV3)反應。
　　應用肽掃描技術對gD蛋白進行GST融合短肽截短表達，對MAb1G3識別的抗原表位進行了鑒定，結果表明MAb1G3識別的最小反應活性單元是6肽260ESKGYE265，識別的最大反應活性的最小單元是7肽259EESKGYE265?？乖砦槐Ｊ匦苑治霰砻?，該抗原表位在IBRV各分

5、離株中完全保守，而在其他與IBRV相關的反芻動物皰疹病毒如山羊皰疹病毒1型(CpHV-1)、鹿皰疹病毒1型(CvHV-1)及駝鹿皰疹病毒1型(ElkHV-1)等差異較大。
　　同時，本研究利用MAb3C2作為捕獲抗體、1F5作為檢測抗體建立了可用于檢測IBRV抗原的雙抗夾心ELISA。特異性實驗表明該方法只針對IBRV，不與BAV-3、BPIV3及牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)等其他引起牛呼吸道疾病的病原反應。通過24份陰性樣品的檢

6、測，確定該方法的Cut-off值為0.24，當樣品OD450值大于0.24時，判定為陽性;等于或低于0.24時判定為陰性。敏感性試驗表明，該方法可以檢測102.9TCID50/0.1 ml的IBRV,與PCR方法檢測臨床樣品的符合率為90.5％。重復性試驗表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。
　　綜上所述，本研究制備了13株IBRV單抗，這些單抗與IBRV具有良好的反應性。對針對gD蛋白的一株中和性單抗1G3進行了表位鑒定，結果鑒定出了一