牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白gD單抗制備及其抗原表位鑒定與雙抗夾心ELISA的建立.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。牛是主要宿主及傳染源。IBRV組織嗜性廣，可引起包括牛的鼻氣管炎、膿性陰道炎、包皮龜頭炎、流產(chǎn)、不孕不育癥、結(jié)膜炎、腦炎等多種臨床癥狀。病毒易于三叉神經(jīng)節(jié)建立潛伏感染，造成病毒的持續(xù)存在并大量排毒，使得IBRV感染難以清除。急性IBRV呼吸道感染引起的牛繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎，

2、是造成養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一。該病于上世紀(jì)50年代在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)呈世界范圍分布。血清學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)大部分地區(qū)存在IBRV感染。gD蛋白是IBRV主要囊膜糖蛋白之一，在病毒的吸附及入侵過(guò)程中具有重要作用，能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的IBRV檢測(cè)方法，國(guó)外的檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，因此，有必要開展相關(guān)檢測(cè)技術(shù)方面的研究。
　　本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)的gD蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)

3、，免疫印跡試驗(yàn)表明其免疫原性良好。用超離純化的IBRV免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，重組gD蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫，經(jīng)常規(guī)細(xì)胞融合，獲得了13株單克隆抗體(MAb)，其中4株(2D8、3F9、1G3、5B7)可與重組gD蛋白和IBRV全病毒反應(yīng)，其余9株(2E4、3C2、4E8、1F5、4H5、6B6、3F3、2A9、4D11)僅與IBRV全病毒反應(yīng)，不與重組gD蛋白反應(yīng)。單抗1G3具有病毒中和活性，中和效價(jià)為1∶32。免疫印跡及間接免疫熒

4、光試驗(yàn)表明這13株單抗具有良好的反應(yīng)性。特異性試驗(yàn)表明這13株單抗只與IBRV反應(yīng)，不與牛腺病毒3型(BAV-3)及牛副流感病毒3型(BPIV3)反應(yīng)。
　　應(yīng)用肽掃描技術(shù)對(duì)gD蛋白進(jìn)行GST融合短肽截短表達(dá)，對(duì)MAb1G3識(shí)別的抗原表位進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明MAb1G3識(shí)別的最小反應(yīng)活性單元是6肽260ESKGYE265，識(shí)別的最大反應(yīng)活性的最小單元是7肽259EESKGYE265?？乖砦槐Ｊ匦苑治霰砻?，該抗原表位在IBRV各分

5、離株中完全保守，而在其他與IBRV相關(guān)的反芻動(dòng)物皰疹病毒如山羊皰疹病毒1型(CpHV-1)、鹿皰疹病毒1型(CvHV-1)及駝鹿皰疹病毒1型(ElkHV-1)等差異較大。
　　同時(shí)，本研究利用MAb3C2作為捕獲抗體、1F5作為檢測(cè)抗體建立了可用于檢測(cè)IBRV抗原的雙抗夾心ELISA。特異性實(shí)驗(yàn)表明該方法只針對(duì)IBRV，不與BAV-3、BPIV3及牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)等其他引起牛呼吸道疾病的病原反應(yīng)。通過(guò)24份陰性樣品的檢

6、測(cè)，確定該方法的Cut-off值為0.24，當(dāng)樣品OD450值大于0.24時(shí)，判定為陽(yáng)性;等于或低于0.24時(shí)判定為陰性。敏感性試驗(yàn)表明，該方法可以檢測(cè)102.9TCID50/0.1 ml的IBRV,與PCR方法檢測(cè)臨床樣品的符合率為90.5％。重復(fù)性試驗(yàn)表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。
　　綜上所述，本研究制備了13株IBRV單抗，這些單抗與IBRV具有良好的反應(yīng)性。對(duì)針對(duì)gD蛋白的一株中和性單抗1G3進(jìn)行了表位鑒定，結(jié)果鑒定出了一