可視化檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒LAMP法的建立及其對流行狀況的初步調查.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)，又稱“紅鼻病”和“壞死性鼻炎”。由牛皰疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus1，BoHV-1)—牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV)，引發(fā)牛的一種急性、熱性、接觸性疫病，主要引起病牛發(fā)熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎和上呼吸道炎癥等，是導致牛養(yǎng)殖業(yè)經濟損失的一個主

2、要原因。目前，我國養(yǎng)牛業(yè)正向規(guī)模化、集約化迅速發(fā)展，國內外活畜和遺傳物質貿易日益頻繁，這給IBR的流行與傳播創(chuàng)造了良好條件。而且我國還沒有市場化疫苗，也未實施監(jiān)測和控制計劃。目前已知絕大多數流行病學報道都是檢測血清IBRV抗體，現有資料表明該病在我國已呈現高度蔓延趨勢，我國養(yǎng)牛業(yè)已遭受極大損失，因此研究該病病原檢測技術和方法，加強病原控制有著非常重要的意義。
　　目前，我國基層牛場由于實驗室的條件限制，調查該病病原的流行情況往往不

3、能及時進行。本研究旨在建立針對病原IBRV的簡便快速的現場檢測方法，利用該方法能夠對病原流行狀況做現場分析。本研究內容由兩個部分組成:
　　第一部分:基于顏色判斷的環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)快速檢測IBRV研究
　　為創(chuàng)建一種檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)的LAMP可視化方法，根據已發(fā)表的IBRV gB基因序列，設計合成了3對擴增IBRV gB

4、基因靶序列的特異性引物，并優(yōu)化了LAMP反應溶液組分，成功創(chuàng)建了IBRV的LAMP可視化檢測法，驗證了其敏感性、特異性以及對臨床樣品的檢測情況。結果表明，該法可在50min內檢測出10copies的標準陽性質粒，且不發(fā)生交叉反應，通過肉眼直接觀察即可判斷結果。檢測臨床樣品發(fā)現，被檢奶牛場IBRV感染嚴重:鼻拭子樣品中IBRV的陽性率介于79.4％-95.7％，總陽性率為84.4％;血清樣品中IBRV的陽性率介于48.2％-69.4％，總

5、陽性率為56.5％。該方法的建立為基層現場檢測IBRV提供了便利，也為快速檢測試劑盒的開發(fā)奠定了基礎。
　　第二部分:牛傳染性鼻氣管炎的流行病學調查
　　為了驗證上海市崇明島奶牛場IBR的流行情況和進行流行病學調查分析，采用套式PCR方法分別對兩個奶牛場的鼻拭子樣品及血清樣品進行IBR病原檢測。結果顯示，鼻拭子樣品中IBRV的陽性率介于77.5％-96.7％，總陽性率為83.4％;血清樣品中IBRV的陽性率介于50.0％-5

6、2.8％，總陽性率為51.1％。與LAMP法檢測的結果相比發(fā)現，兩檢測方法符合率高（總符合率為92.4％）;卡方檢驗（McNemar檢驗）表明，兩法對樣品中IBRV的檢出率差異不顯著，證明了LAMP檢測法的可靠性。病原學分析表明:本研究所擴得序列BHV-1/SH309與巴西毒株IBR6813(DQ006851),BH81(DQ006854), LD30/2(DQ006855), LD15(AY758382)以及AY330349的同源性在