牛傳染性鼻氣管炎和赤羽病分子檢測方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎（IBR）和赤羽?。ˋKA）是兩種重要的危害養(yǎng)牛業(yè)的病毒性傳染疾病，曾給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，我國進(jìn)出口境牛及其相關(guān)產(chǎn)品大多要求對(duì)這兩種疫病進(jìn)行檢疫。目前檢測IBR和AKA的方法主要有免疫熒光抗體試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、電鏡技術(shù)和膠體金等技術(shù)，這些方法對(duì)檢測IBRV和AKAV起到了重要作用，但同時(shí)也存在特異性不強(qiáng)、靈敏性差、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。迫切需要建立早期的快速、準(zhǔn)確的牛病診斷方法，以預(yù)防和清除該類傳染病隱性

2、感染，確實(shí)保護(hù)我國畜牧業(yè)的健康快速發(fā)展。本研究成功建立了檢測牛傳染性鼻氣管炎（IBR）和赤羽?。ˋKA）的快速檢測體系，包括多重PCR、基因芯片和熒光定量PCR法，并優(yōu)化了一系列反應(yīng)條件，建立了相應(yīng)的檢測試劑盒，大大加快了牛傳染性鼻氣管炎（IBR）和赤羽?。ˋKA）的檢測速度并提高了靈敏度?，F(xiàn)將所做工作介紹總結(jié)如下：
　　(1)雙重PCR檢測體系。根據(jù)牛皰疹病毒1型(BHV1)gB基因序列和赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,設(shè)計(jì)

3、了2對(duì)針對(duì)這2種病毒的特異引物，成功構(gòu)建了包含擴(kuò)增片段的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。建立和優(yōu)化了2種病毒的多重PCR檢測體系，經(jīng)優(yōu)化后確定退火溫度Tm值為59℃，Mg2+濃度為1.5nmol/μL。雙重PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒檢測靈敏度IBRV的靈敏度為0.13pg/25μL，AKAV的靈敏度為1.04pg/25μL。
　　(2)基因芯片檢測方法。在雙重PCR的基礎(chǔ)上，在所擴(kuò)增片段中設(shè)計(jì)特異性、保守性的寡核苷酸探針，擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，用熒光素Cy3標(biāo)記正向

4、引物的5′端。實(shí)驗(yàn)確定了適宜雜交溫度為38℃?；蛐酒瑱z測陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒IBRV的靈敏度為0.013pg/25μL，AKAV的靈敏度為0.104pg/25μL。
　　(3)熒光定量PCR法。在所構(gòu)建的兩種病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；A(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，通過對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了SYBR Green I熒光定量PCR分別檢測IBRV和AKAV的方法。檢測IBRV陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的靈敏度為1.3fg（相當(dāng)于360copie