牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因的截短表達(dá)與間接ELISA診斷方法的建立.pdf

1、本研究根據(jù)GenBank發(fā)布的牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)全基因序列，利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)合成gB基因的特異性引物，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增gB開放閱讀框第190-524氨基酸殘基(aa)的基因。對(duì)目的片段進(jìn)行克隆、酶切及測(cè)序鑒定后，產(chǎn)物插入pET-30a載體中，轉(zhuǎn)化至表達(dá)大腸桿菌Rosetta，以構(gòu)建pET-30a-gB(190-524)重組質(zhì)粒。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，該表達(dá)產(chǎn)物以大小為41.4Ku的包涵體形式

2、存在。Western blot（免疫印跡試驗(yàn)）結(jié)果顯示該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。以純化的gB截短蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA診斷方法。確定的抗原包被濃度為1.25g/mL，血清的最佳稀釋度為1∶20，S/P≥0.294判定為陽(yáng)性。本方法對(duì)牛病毒性腹瀉(BVD)、口蹄疫(FMD)、牛結(jié)核(BTB)、布病(BR)4種疾病陽(yáng)性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)。組內(nèi)變異系數(shù)低于10％，組間變異系數(shù)低于11％。與IDEXX公司的gB-ELISA商品化

3、試劑盒進(jìn)行比較，陽(yáng)性符合率為84.28％，陰性符合率為85.71％。本研究建立的ELISA方法為疾病防制工作提供參考。
　　對(duì)黑龍江省哈爾濱、阿城、密山、綏化、齊齊哈爾、饒河、黑河七個(gè)地區(qū)的10個(gè)牛場(chǎng)的血清樣品進(jìn)行了牛傳染性鼻氣管炎的血清學(xué)調(diào)查，共1377份，陽(yáng)性率最高為65.52％，最低為5.56％。2009至2014年間，其中2011年被檢血清抗體陽(yáng)性率最高為37.22％，2012年被檢血清抗體陽(yáng)性率最低為10.23％，并且2