表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組馬立克病毒疫苗株的構(gòu)建.pdf

1、雞傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV)引起的急性呼吸道疾病。該病具有急性爆發(fā)和潛伏感染的特點(diǎn)，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于ILTV弱毒疫苗能引起潛伏感染，并且在雞群中的傳播會(huì)造成毒力返強(qiáng)，從而成為新的感染來源;因此，迫切需要研制安全、高效的新型ILT疫苗。本研究以馬立克氏病毒(MDV

2、) CVI988/Rispens疫苗毒株為載體，構(gòu)建表達(dá)ILTV保護(hù)性抗原gB糖蛋白的重組病毒，并分別評(píng)價(jià)重組病毒對(duì)ILT和馬立克氏病的免疫效果。
　　本研究以CVI988/Rispens疫苗毒株基因組短獨(dú)特區(qū)的sorf1和sorf2作為ILTV gB基因插入位點(diǎn)，以網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）的長末端重復(fù)序列(LTR)為啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白(EGFP)基因?yàn)閳?bào)告基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDV-gB-GFP。用磷酸鈣共沉淀法將pM

3、DV-gB-GFP和CVI988/Rispens基因組DNA共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞，獲得帶有EGFP標(biāo)志的重組病毒;經(jīng)有限稀釋法純化、篩選，獲得帶有EGFP標(biāo)志的重組病毒rMDV-gB-GFP。用Cre重組酶去除rMDV-gB-GFP的EGFP基因，得到重組病毒rMDV-gB。經(jīng)PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和Western-blot試驗(yàn)鑒定，證明重組病毒rMDV-gB基因組中插入了ILTV gB基因，并能表達(dá)ILTV gB

4、糖蛋白。
　　本研究評(píng)價(jià)了rMDV-gB對(duì)ILTV強(qiáng)毒株攻擊的免疫保護(hù)效果。將90只1日齡SPF雞隨機(jī)分成4組:rMDV-gB免疫組、rMDV-gB與ILTV弱毒疫苗聯(lián)合免疫組、ILTV弱毒疫苗免疫組、攻毒對(duì)照組。前兩組的試驗(yàn)雞1日齡時(shí)分別頸部皮下接種5000空斑形成單位(PFU)的rMDV-gB;第二組和第三組的試驗(yàn)雞于21日齡時(shí)接種1羽份的ILTV弱毒疫苗;42日齡時(shí)，各組試驗(yàn)雞均用105 EID50/雞的ILTV強(qiáng)毒株攻擊。

5、觀察試驗(yàn)雞的癥狀表現(xiàn)，并于攻毒后第10天進(jìn)行剖檢和病理組織學(xué)檢查。結(jié)果顯示，在ILTV強(qiáng)毒株攻擊后，rMDV-gB免疫組的保護(hù)率為65％，而ILTV弱毒疫苗組的保護(hù)率為41％，rMDV-gB的保護(hù)效力明顯高于ILTV弱毒疫苗。本研究還發(fā)現(xiàn)，在1日齡雛雞接種rMDV-gB后，再于21日齡接種ILTV弱毒疫苗，并不能提高對(duì)ILTV強(qiáng)毒株攻擊的保護(hù)作用;表明1日齡雛雞接種rMDV-gB后就能建立起針對(duì)ILTV的有效免疫力。
　　本研究還

6、評(píng)價(jià)了rMDV-gB對(duì)MDV RB1B超強(qiáng)毒株攻擊的免疫保護(hù)效果。將60只1日齡SPF雞隨機(jī)分為3個(gè)試驗(yàn)組:rMDV-gB免疫組、CVI988/Rispens免疫組、攻毒對(duì)照組，每組20只試驗(yàn)雞;rMDV-gB免疫組和CVI988/Rispens免疫組的試驗(yàn)雞分別于1日齡時(shí)頸皮下接種5000 PFU/雞的相應(yīng)疫苗;7日齡時(shí)，所有試驗(yàn)雞經(jīng)腹腔接種500 PFU/雞的MDV RB1B超強(qiáng)毒株。連續(xù)觀察90天，記錄各試驗(yàn)組雞的發(fā)病和死亡情況。