三株雞傳染性喉氣管炎病毒的部分基因序列及免疫原性分析.pdf

1、雞傳染性喉氣管炎(Avian Infectious Laryngotracheitis，AILT)是由傳染性喉氣管炎病毒引起的一種急性、接觸性上部呼吸道傳染病。其特征是呼吸困難、咳嗽和咳出含有血樣的滲出物。剖檢時(shí)可見喉部、氣管粘膜腫脹、出血和糜爛。在病的早期患部細(xì)胞可形成核內(nèi)包涵體。本病1925年在美國(guó)首次報(bào)道后，現(xiàn)已遍及世界許多養(yǎng)雞地區(qū)。本病傳播快，死亡率較高，在中國(guó)較多地區(qū)發(fā)生和流行，危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。雞傳染性喉氣管炎是第一個(gè)通過(guò)有

2、效疫苗免疫接種獲得防控的傳染病。常用于預(yù)防和控制ILT的疫苗為弱毒活I(lǐng)LT疫苗，但該疫苗可引起潛伏感染，并且在雞群與雞群的傳播過(guò)程中病毒毒力增強(qiáng)返祖，安全性差，容易引起發(fā)病所以存在很大的應(yīng)用限制。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)三株雞傳染性喉氣管炎病毒分離株的部分基因及免疫原性進(jìn)行分析，從而為雞傳染性喉氣管炎疫苗的研究提供一定的參考資料。
　　首先對(duì)三株疑似雞傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行分離和初步鑒定，以雞胚絨毛尿囊膜(CAM)接種法接種SPF雞胚并觀察其

3、培養(yǎng)特性，收集絨毛尿囊膜及尿囊液，提取基因組DNA，然后根據(jù)GenBank發(fā)表的雞傳染性喉氣管炎病毒gB、gC、gD、gG基因保守序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物對(duì)其基因組DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，以及膠回收-連接-克隆-序列測(cè)定，序列分析表明，獲得的核苷酸序列與GenBank發(fā)表的序列相似性均在99％以上，存在很高的同源性。
　　其次對(duì)這三株病毒進(jìn)行免疫原性分析，病毒株感染的絨毛尿囊膜凍融后的上清和尿囊液混合喉內(nèi)接種試驗(yàn)雞，同時(shí)ILTV商品弱毒

4、疫苗經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻途徑免疫試驗(yàn)雞，并設(shè)置非免疫對(duì)照雞組。分別于免疫后7d、14d、21d采血分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)行RNA提取與反轉(zhuǎn)錄，采用相對(duì)熒光定量PCR方法（選擇β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用SYBRGreen染料法）檢測(cè)IL-2、IL-6的表達(dá)量變化。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和分析熔解曲線。并于免疫后21天用ILTV強(qiáng)毒感染所有試驗(yàn)雞，于28d、35d采血檢測(cè)IL-2、IL-6的表達(dá)量變化及統(tǒng)計(jì)各組的免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，各基因的CT值檢測(cè)范圍在15