傳染性喉氣管炎（ILTV）重組雞痘病毒（rFPV-gB-gD-IgG）和DNA（pcDNA-gB）疫苗對雞免疫效果的研究.pdf

1、傳染性喉氣管炎(Inctious laryngotractheitis，ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起的雞的一種急性上呼吸道傳染病。該病分布于世界各地，被OIE列為B類傳染病。上世紀(jì)60年代，我國也發(fā)現(xiàn)本病。此后，相繼在許多省市流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前國內(nèi)外主要使用弱毒疫苗預(yù)防本病，但它們都存在著疫苗株毒力偏強(qiáng)、潛伏感染、易于返祖以及疫苗株和野毒株無法鑒別的缺點(diǎn)，從而不利于ILT的根除。隨著分子生物學(xué)

2、的發(fā)展，利用基因工程疫苗預(yù)防ILT已成為人們的共識。其中重組病毒活疫苗由于其自身優(yōu)勢，成為防制傳染病的研究熱點(diǎn)；而核酸疫苗也越來越受到研究者的關(guān)注。本研究利用雞痘病毒弱毒疫苗株282 E4株為載體，構(gòu)建了表達(dá)ILTV煙臺株gB及gD主要抗原表位基因和雞IgG重鏈恒定區(qū)基因的重組雞痘病毒；并構(gòu)建了包含ILTV主要抗原基因的DNA疫苗，檢測了兩種疫苗單獨(dú)或聯(lián)合使用時，誘導(dǎo)雞產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫情況。研究主要包括以下幾個方面： 1

3、.傳染性喉氣管炎病毒煙臺株g B基因的克隆和D N A疫苗的構(gòu)建 以傳染I陛喉氣管炎病毒(ILTV)煙臺株基因組DNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的ILTVSA-2株基因序列設(shè)計(jì)并合成l對引物，在上下游分別添加Kpn Ⅰ和ApaⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增出一條2.7kb的片段，測序結(jié)果表明：gB基因長2619bp，包含完整的閱讀框架，編碼873個氨基酸。將該片段亞克隆到pcDNA3.5真核表達(dá)載體中，酶切分析表明成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDN

4、A-gB。參照《分子克隆》大量提取質(zhì)粒pcDNh-gB轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，間接免疫熒光表明該蛋白獲得表達(dá)，為下一步DNA免疫奠定了基礎(chǔ)。 2.目的片段的選取及重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pEr-gB-gD-IgG的構(gòu)建 以傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)煙臺株基因組DNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的ILTVSA-2株基因序列設(shè)計(jì)并合成2對引物，分別擴(kuò)增其gB和gD的主要抗原表位基因，同時人工合成IgG重鏈恒定區(qū)第900～1400基因。在g

5、B上游引物5’端添加ATG GCG，gD上游引物5’端設(shè)計(jì)一個9個氨基酸的linker(-GSLAGALGL-)，在合成的IgG重鏈恒定區(qū)基因3’端添加TAA，使gB及gD主要抗原表位基因與IgG重鏈恒定區(qū)基因連接后形成一個完整的閱讀框架。將gB和gD片段分別亞克隆到pBluescript Ⅱ SK(十)中，得到重組質(zhì)粒pSK-gB-gD。然后將從重組質(zhì)粒pSK-gB-gD酶切回收得到的gB-gD基因片段和人工合成的IgG重鏈恒定區(qū)片段

6、亞克隆到雞痘病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pEFgptl2s中。經(jīng)酶切分析和PCR鑒定，表明已成功構(gòu)建了重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pEF-gB-gD-IgG，為進(jìn)一步在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染并獲得表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB及gD主要抗原表位基因和雞IgG重鏈恒定區(qū)基因的重組雞痘病毒奠定了基礎(chǔ)。3.目的片段在重組雞痘病毒中的表達(dá)及重組病毒生物學(xué)特性的研究 利用脂質(zhì)體法，將構(gòu)建好的重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體pEF-gBgD-IgG轉(zhuǎn)染已感染雞痘病毒282E4疫苗株2h的次代雞

7、胚成纖維細(xì)胞，待出現(xiàn)明顯病變后收毒，用藥物篩選培養(yǎng)基(MXHAT)在24孔板上進(jìn)行連續(xù)篩選純化，得到重組病毒rFPV-gBgD-IgG。利用PCR以及ILTV陽性血清和熒光標(biāo)記羊抗雞IgG進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定，可見陽性重組病毒表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生特異性熒光，同時分別擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的片段。Western blot檢測結(jié)果顯示，目的片段在重組雞痘病毒感染的CEF中也獲得了表達(dá)。以上結(jié)果表明：成功構(gòu)建了表達(dá)ILTVgB及gD主要抗原表

8、位基因扣IgG基因的重組雞痘病毒且表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性。連續(xù)傳10代后，重組病毒在2％MEM和2％MXHAT選擇性培養(yǎng)基中均生長良好，與親本株FPV出現(xiàn)病變的時間及病毒滴度基本達(dá)到一致，表明外源基因的引入不影響雞痘病毒的復(fù)制，且構(gòu)建的重組病毒具較好的穩(wěn)定性，從而為傳染性喉氣管炎新型基因工程疫苗的研制打下了良好的基礎(chǔ)。4.重組雞痘病毒和DNA疫苗對雞的免疫效果試驗(yàn)雞50只四周齡非免疫雞隨機(jī)分成5組，每組10只。第一組經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻方式接種IL

9、T毒疫苗；第二組經(jīng)肌肉注質(zhì)粒peDNA-gB；第三組經(jīng)翅皮下注射接種重組雞痘病毒rFPV-gBgD-IgG；第四組rFPV-gBgD-IgG/peDNA-gB共免疫雞；第五組經(jīng)肌肉注射生理鹽水。于免疫兩周后，每間隔一周每組隨機(jī)取5只雞經(jīng)靜脈采血分離血清，ELIsA檢測實(shí)驗(yàn)雞的抗體產(chǎn)生和滴度變化表明：質(zhì)粒組和重組雞痘病毒組免疫后第二周血清抗體為陽性，而對照組均為陰性，弱毒疫苗組在免疫后第三周血清抗體為陽性，各免疫組抗體水平可持續(xù)到第9周。