牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR檢測(cè)方法的建立及在進(jìn)境牛檢疫中的應(yīng)用.pdf

1、我國(guó)廣東、廣西、河南、河北、上海、山東、四川、甘肅、新疆、黑龍江和青海等地的黑白化奶牛、本地黃牛、水牛或牦牛均有IBR存在。該病廣泛分布于世界各地，迄今只有奧地利、丹麥、芬蘭、瑞士和瑞典消滅了該病，一些國(guó)家已啟動(dòng)了控制程序。 該病的典型癥狀主要出現(xiàn)在上呼吸道，如化膿性鼻液伴有結(jié)膜炎，一般癥狀有發(fā)燒、抑郁、厭食、流產(chǎn)和奶產(chǎn)量下降。病毒感染生殖道導(dǎo)致外陰道炎和龜頭皮炎。該病雖死亡率較低，許多感染牛呈亞臨床癥狀經(jīng)過，但常處于潛伏感染和

2、長(zhǎng)期排毒，在運(yùn)輸、擁擠等應(yīng)急條件下常導(dǎo)致發(fā)病及繼發(fā)感染，由于其流行范圍廣，對(duì)牛產(chǎn)奶量、繁殖力和役牛的使役能力均有較大影響，并嚴(yán)重影響國(guó)際牛業(yè)貿(mào)易。 清除抗體陽(yáng)性牛，排除潛伏感染動(dòng)物是控制IBR的最簡(jiǎn)單也是最好的方法。奧地利、丹麥、芬蘭、瑞士和瑞典等國(guó)由于采取捕殺抗體陽(yáng)性牛，已將本病消滅。此捕殺措施是基于抗體陽(yáng)性牛為病毒的攜帶者這一事實(shí)，所以關(guān)鍵問題是要建立一種足夠敏感的方法檢出IBR陽(yáng)性牛。對(duì)IBR疾病的監(jiān)測(cè)與診斷，國(guó)際上已普遍

3、使用ELISA和病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行BHV1抗體檢測(cè)，或從鼻拭子和其它臟器分離病毒并進(jìn)行病原鑒定。到目前為止，PCR主要應(yīng)用于精液病毒檢測(cè)，而實(shí)驗(yàn)證明PCR能夠快速靈敏的檢測(cè)牛的IBRV，特別是對(duì)IBRV的潛伏感染的診斷，在IBR的診斷特別是在牛業(yè)國(guó)際貿(mào)易中具有廣闊的應(yīng)用前景。 對(duì)進(jìn)口牛的檢疫，我國(guó)目前的檢測(cè)方法是：在隔離檢疫期間，主要應(yīng)用ELISA或SN檢測(cè)血清樣品中BHV1抗體，采取BHV1抗體陽(yáng)性牛鼻拭子樣品，接種MDBK細(xì)胞

4、，再用SN鑒定培養(yǎng)物中引起CPE的病毒，由于SN對(duì)技術(shù)要求較高，所需時(shí)間長(zhǎng)，本文改用PCR鑒定病毒，簡(jiǎn)便快速。 本研究根據(jù)BHV1的gB基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)IBRV進(jìn)行PCR檢測(cè)，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用于進(jìn)口牛檢疫，結(jié)果，最佳反應(yīng)條件為：變性溫度為95℃，退火溫度為64℃，72℃延伸，循環(huán)次數(shù)為35個(gè)循環(huán)，Mg2+的最佳濃度為1.6mM，dNTPs的最佳反應(yīng)濃度為0.36mM，引物的最佳濃度為0.2pmol/uL，Taq

5、酶的最佳濃度0.4U/50uL。用這對(duì)引物擴(kuò)增IBRV、HCV、PRRSV、PRV，只有IBRV擴(kuò)增出期望的362bp的特異性條帶，具有特異性。該P(yáng)CR方法的檢測(cè)敏感度為1.2ng/50uL，說(shuō)明其具有很好的敏感性。 在對(duì)3000多頭進(jìn)口奶牛實(shí)施隔離檢疫期間，采取其血清進(jìn)行牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的ELISA檢測(cè)，結(jié)果血清IBR抗體陽(yáng)性數(shù)量達(dá)到1293頭，陽(yáng)性率高達(dá)42﹪。采集陽(yáng)性牛鼻拭子用MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，應(yīng)用以上所建

6、立的PCR反應(yīng)體系對(duì)病毒分離物進(jìn)行檢測(cè)，從5份分離物中擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)大小(362bp)相吻合的基因片段，測(cè)序結(jié)果表明該序列與IBR標(biāo)準(zhǔn)毒株的序列完全一致。這些病毒分離株用BHV1陽(yáng)性血清進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)，病毒能被陽(yáng)性血清中和，MDBK細(xì)胞不出現(xiàn)CPE，而用陰性血清則出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，即細(xì)胞變圓、卷縮成葡萄串樣等。同時(shí)將分離毒作負(fù)染電鏡觀察，可見病毒粒子呈球形，含囊膜，直徑約175～200nm。PCR檢測(cè)結(jié)果與SN、序列分析及電鏡觀察結(jié)果