棗果實(shí)總RNA的提取及其反轉(zhuǎn)錄技術(shù)體系的建立.pdf

1、棗(ZiziphusjujubaMill.)是我國(guó)特有果樹(shù)資源。棗果營(yíng)養(yǎng)豐富，用途廣泛，深受人們喜愛(ài)。棗適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿，是適于山區(qū)和鹽堿地區(qū)栽種的理想經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。以無(wú)核小棗和金絲小棗不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)為試材，建立適宜棗果實(shí)總RNA提取的方法及其反轉(zhuǎn)錄的技術(shù)體系，為進(jìn)一步進(jìn)行棗果實(shí)cDNA-AFLP分析及有關(guān)的分子生物學(xué)操作，闡明棗無(wú)核突變體的分子機(jī)理，并克隆棗果實(shí)無(wú)核突變體相關(guān)基因，通過(guò)基因工程培育優(yōu)良的無(wú)核棗品種奠定基礎(chǔ)

2、。研究主要內(nèi)容如下：1.試驗(yàn)在參照大量總RNA提取方法的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了棗果實(shí)總RNA的提取方法，即改良SDS法。通過(guò)比較改良CTAB法和本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的SDS法對(duì)棗果實(shí)總RNA的提取結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本研究設(shè)計(jì)的SDS法提取總RNA的質(zhì)量更高，效果更好。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)設(shè)計(jì)的SDS法優(yōu)化，即重點(diǎn)研究了最佳試材的用量、無(wú)水乙醇和異丙醇沉淀RNA效果的比較、LiCl去除多糖的效果以及LiCl和無(wú)水乙醇沉淀RNA先后順序不同對(duì)RNA的影響等方面，確定了棗果實(shí)

3、總RNA提取最佳技術(shù)體系，該體系提取的棗果實(shí)總RNA無(wú)降解、無(wú)污染，OD260/OD280為1.8-2.0；OD280/OD230大于2.0。利用該體系提取了金絲小棗和無(wú)核小棗不同時(shí)期的果實(shí)總RNA。 2.棗果實(shí)不同發(fā)育階段RNA含量不同，發(fā)育早期階段RNA含量高。 3.研究了無(wú)水乙醇、異丙醇沉淀RNA的效果，確定了最佳沉淀RNA的方法，即2.5倍體積的無(wú)水乙醇效果最好。 4.建立了適合棗果實(shí)總RNA的純化技術(shù)體

4、系，確定了合適的DNase的用量，即40μL體系中，DNase的用量為10U。 5.建立了棗果實(shí)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA技術(shù)體系。其中，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈體系為：10μL體系中，含有5μL純化后的RNA，1.625μLOligo(dT)15，0.125μLRNA酶抑制劑(40U/μL)，1μL10mmol/μLdNTPs，2μL5倍RTase-AMV緩沖液，0.25μLRTase-AMV(10U/μL)；合成第二條鏈cDNA體系為