杉木、楊樹激光顯微切割體系的建立及RNA質(zhì)量的控制.pdf

1、激光顯微切割技術(shù)(Laser Microdissection，LMD)是在顯微下通過(guò)顯微操作系統(tǒng)對(duì)欲選取的材料(組織，細(xì)胞群，細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)組分或染色體區(qū)帶等)進(jìn)行切割分離并收集用于后續(xù)研究的技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確且操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。它成功的解決了大塊分離組織中的細(xì)胞功能異質(zhì)性問(wèn)題，是分子生物學(xué)和基因組學(xué)一項(xiàng)革命性的技術(shù)。近幾年來(lái)，激光顯微切割技術(shù)逐漸從動(dòng)物和醫(yī)學(xué)研究中拓展到植物研究中來(lái)，用于快速準(zhǔn)確地將目標(biāo)細(xì)胞或細(xì)胞群從植物組織中分離，進(jìn)行

2、后續(xù)的分子和生化分析。 木材的徑向生長(zhǎng)是維管形成層向內(nèi)分化為次生木質(zhì)部和向外分化為次生韌皮部的結(jié)果。利用分子和細(xì)胞學(xué)的方法研究木材的形成的基因表達(dá)與調(diào)控是科學(xué)家們近年來(lái)努力要解釋的重要科學(xué)問(wèn)題。但由于傳統(tǒng)的方法很難將影響木材形成的關(guān)鍵活性組織區(qū)域形成層從或提上加以完整和清晰分離，人們對(duì)形成層的認(rèn)識(shí)還相當(dāng)有限。如何提高取材部位的準(zhǔn)確性，是研究形成層區(qū)細(xì)胞分化分子機(jī)理的關(guān)鍵所在。20世紀(jì)90年代由于激光顯微切割技術(shù)的進(jìn)展使得這方法的

3、研究變得容易起來(lái)。 本研究首先用杉木、楊樹兩種樹種為實(shí)驗(yàn)材料，建立了莖段的冰凍切片技術(shù)。通過(guò)對(duì)杉木、楊樹試管苗實(shí)施不同的固定方法和預(yù)處理方法，確定了以卡諾固定、蔗糖磷酸緩沖液保護(hù)加液氮冷凍的方法制片。冰凍切片的適宜條件為：卡諾固定4-6小時(shí)，10％蔗糖磷酸緩沖液保護(hù)6-12小時(shí)，OCT包埋之后用液氮冷凍50s-90s。切片后脫水處理對(duì)切片的質(zhì)量有一定程度的改善。建立的冰凍切片方法成功應(yīng)用到田間杉木和楊樹材料中，最薄切片厚度可至1

4、0μm，切片清晰完整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)易于辨認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究了木本植物莖段的切片方法，突破了木本植物冰凍切片易破碎的瓶頸，為激光顯微切割技術(shù)在木本植物的細(xì)胞分子生物學(xué)研究中應(yīng)用打下扎實(shí)的基礎(chǔ)。 用Leica AS LMD激光顯微切割系統(tǒng)切割杉木、楊樹田間材料的冰凍切片，厚度為12μm，10×物鏡下，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的激光參數(shù)為：Aperture 10～13，Intensity 45～46，Speed 3～5。分別收集了約6000個(gè)形成層細(xì)胞

5、。用Qiagen RNeasy Micro Kit抽提RNA。由于從顯微切割的組織中提取的為微量RNA，不能用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳均不能檢出。本研究首先用RT-PCR檢驗(yàn)RNA。用β-Actin引物擴(kuò)增出了400bp左右的條帶。說(shuō)明RNA大部分沒有降解。用杉木特異性引物Expansin 2全長(zhǎng)引物擴(kuò)增杉木形成層cDNA，擴(kuò)增出約1400bp的條帶，說(shuō)明RNA完整性較好。 從6000個(gè)楊樹形成層細(xì)胞中提取的RNA，用Ag

6、ilent 2100 Bioanalyzer分析，RNA濃度：1395 pg/μl；rRNA Ratio[28S/18S]：1.3；RNA Integrity Number[RIN]：7.1。RNA完整性較高，基本沒有降解。從毛細(xì)管電泳圖中可以看出18S和28S的熒光峰狹長(zhǎng)且很高，說(shuō)明了RNA純度比較高，沒有DNA的污染。經(jīng)過(guò)激光顯微切割的楊樹形成層細(xì)胞的RNA的產(chǎn)出率為2.325pg total RNA/cell。該RNA的質(zhì)量較好，