牡丹Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆和分析.pdf

1、牡丹（Paeonia suffruticosaAndrews.）芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia L.）牡丹組（Sect.Mouton DC.）落葉灌木，是重要的觀賞和資源植物。在我國(guó)已有2000余年的栽培及應(yīng)用歷史，在長(zhǎng)期的栽培和人工選擇下，形成了豐富的遺傳變異。但目前關(guān)于牡丹基因組內(nèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)首次從牡丹基因組中分離了 Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)地分析。

2、主要結(jié)果如下：
　　1.采用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后反應(yīng)體系為：1×buffer，2mmol/L Mg2+，0.4mmol/L dNTPs，0.8μmol/L簡(jiǎn)并引物（RTS和RTF），1U Taq酶，DNA模板50ng/μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)定為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，43℃退火50s，72℃延伸1min，72℃再延伸7min，4℃終止反應(yīng)，其中變性、退火和延

3、伸三個(gè)步驟循環(huán)35次。從代表牡丹組植物的10個(gè)種中都擴(kuò)增得到了約300bp的目的產(chǎn)物。所有材料擴(kuò)增結(jié)果一致，且無(wú)目的產(chǎn)物以外的擴(kuò)增條帶。結(jié)果說(shuō)明Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶基因廣泛存在于牡丹組植物中。
　　2.利用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增方法從洛陽(yáng)紅（P.suffruticosacv. Luoyanghong）基因組中成功克隆了59條反轉(zhuǎn)錄酶序列。通過(guò)CLUSTAL、MEGA和 DNAstar軟件對(duì)序列進(jìn)行分析可得：堿基序列長(zhǎng)

4、度變化范圍為：267bp～585bp，同源性變化范圍為：13.8％～92.6%。將59條序列翻譯為氨基酸后其中54條序列都存在1～9個(gè)數(shù)量不等的終止密碼子突變。長(zhǎng)度相同的堿基序列翻譯為氨基酸后也存在著很大的差異，這充分說(shuō)明牡丹基因組中該序列存在堿基插入和替代突變。
　　3.根據(jù)牡丹基因組中Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列的同源性高低，將其劃分為9個(gè)不同的Family（Family1～9）。其中不同F(xiàn)amily含有不同的

5、序列條數(shù)，F(xiàn)amily1包括30條序列，覆蓋了所得序列的50%左右，說(shuō)明其存在的歷史最久遠(yuǎn)，其中反轉(zhuǎn)錄酶所對(duì)應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性就越大。Family4、Family8和Family9各含有1條序列，它們相互之間以及與其它家族之間關(guān)系都較遠(yuǎn)，說(shuō)明其存在的歷史比較短。
　　4.將牡丹中反轉(zhuǎn)錄酶序列與GenBank中不同物種的28條同源序列進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)牡丹與矮牽牛、小花矮牽牛、番茄、鷹嘴豆、列當(dāng)、馬鈴薯、白皮松、寧夏枸杞