二化螟Ty3-gypsy反轉(zhuǎn)座子的克隆與序列分析.pdf

1、二化螟為鉆蛀性害蟲，廣泛分布于我國各水稻產(chǎn)區(qū)，近年來危害加重。二化螟分布廣且呈現(xiàn)周期性爆發(fā)的特點，這可能與其種群的遺傳多樣性及其在不同生境中的遺傳適應分子機制相關(guān)。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主體內(nèi)可以移動的DNA序列，當反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)座以及增殖時，變異不斷被積累遺傳，最終導致種群的分化以及物種的變異。大量證據(jù)表明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是生物基因組進化的重要動力，同時也是物種多樣性形成的主要來源。轉(zhuǎn)座子已成為研究基因功能與表達調(diào)控、生物多樣性及生物

2、進化機制的重要工具（或標記）。研究發(fā)現(xiàn)，二化螟體內(nèi)含有大量的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列。因此，利用二化螟體內(nèi)的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)座子對二化螟的種群遺傳多樣性進行研究。
　　本文利用二化螟體內(nèi)已知的一條Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子序列片段，通過反向PCR和基因組步移等方法成功克隆獲得了一條完整的Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子序列，對該反轉(zhuǎn)座子序列進行了較系統(tǒng)的研究與分析。再者，對二化螟Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子序列中的天冬氨酰蛋白酶(AP)基因進行了較系統(tǒng)

3、的研究與分析。最后，對二化螟體內(nèi)兩種類型轉(zhuǎn)座子序列的單堿基變異特點進行了細致的比對分析。本文的研究，一方面使我們對二化螟Ty3/gypsy內(nèi)源性反轉(zhuǎn)座子的序列結(jié)構(gòu)特征等有了一個系統(tǒng)性的認識;另一方面，通過對這兩種類型轉(zhuǎn)座子序列變異的研究，使對二化螟內(nèi)源性反轉(zhuǎn)座子序列的變異特點有了深刻的了解?？梢詫⑿驴寺～@得的二化螟Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子進一步用于二化螟地理種群遺傳多樣性的研究，將二化螟種群發(fā)生與變異的生態(tài)因素和內(nèi)源分子遺傳因素相結(jié)合

4、，認識與二化螟種群遺傳多樣性相適應的分子形成機制。為闡明二化螟種群消長和爆發(fā)成災的遺傳適應機制提供理論依據(jù)。
　　一、二化螟Ty31gypsy反轉(zhuǎn)座子的克隆與序列分析
　　基于二化螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的一條Ty3/gypsy類反轉(zhuǎn)座子序列片段，利用反向PCR和Genome Walking方法成功克隆出Ty3/gypsy類反轉(zhuǎn)座子的全長序列，命名為Csu-Ty3（GenBank登錄號:KJ191261）。該序列全長4939bp，在

5、基因組上插入的靶位點是“AACGT”，兩端的LTR不完全相同，5'端LTR長161 bp，3'端LTR長168bp，兩者的一致度為93.5％。經(jīng)ORF Finder分析，Csu-Ty3中包含三個獨立的ORF，從左到右依次編碼GAG蛋白、AP蛋白和一個多聚蛋白。Southern雜交顯示二化螟不同地理種群中均有較多的Csu-Ty3拷貝。在特定基因座位上，除了德陽和江津種群中有些個體在該位點上沒有檢測到Csu-Ty3拷貝的插入，其余種群中在該

6、位點上均含有Csu-Ty3拷貝的插入。
　　二、二化螟Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子天冬氨酰蛋白酶（AP）序列的克隆與分析
　　本文首次系統(tǒng)研究了二化螟Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子的AP基因序列(GenBank:KF886014)。AP基因具有獨立的開放閱讀框，長528 bp，編碼的蛋白舍175個氨基酸殘基。該蛋白中含有一個特異的Asp_protease_2保守功能域。對同一基因座位上的AP序列多重比對分析，發(fā)現(xiàn)共存在46處堿基替

7、換，其中堿基轉(zhuǎn)換有31處，堿基顛換有15處，A→G的變異形式出現(xiàn)最多，有15處;其次是T→C的變異形式，有11處;其余的變異形式都很少，但絕大部分拷貝的ORF完整，能編碼完整的蛋白。
　　三、二化螟體內(nèi)兩種類型轉(zhuǎn)座子單堿基變異特點分析
　　利用多重序列比對分析軟件，分別對二化螟體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的DNA型轉(zhuǎn)座子和RNA型轉(zhuǎn)座子進行獨立的多重序列比對分析，發(fā)現(xiàn)這兩種類型的轉(zhuǎn)座子序列在單個堿基的替換中表現(xiàn)出相似的特點。單堿基的轉(zhuǎn)換數(shù)均顯著