二化螟Ty3-gypsy反轉(zhuǎn)座子的克隆與序列分析.pdf

1、二化螟為鉆蛀性害蟲，廣泛分布于我國各水稻產(chǎn)區(qū)，近年來危害加重。二化螟分布廣且呈現(xiàn)周期性爆發(fā)的特點，這可能與其種群的遺傳多樣性及其在不同生境中的遺傳適應(yīng)分子機(jī)制相關(guān)。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主體內(nèi)可以移動的DNA序列，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)座以及增殖時，變異不斷被積累遺傳，最終導(dǎo)致種群的分化以及物種的變異。大量證據(jù)表明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是生物基因組進(jìn)化的重要動力，同時也是物種多樣性形成的主要來源。轉(zhuǎn)座子已成為研究基因功能與表達(dá)調(diào)控、生物多樣性及生物

2、進(jìn)化機(jī)制的重要工具（或標(biāo)記）。研究發(fā)現(xiàn)，二化螟體內(nèi)含有大量的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列。因此，利用二化螟體內(nèi)的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)座子對二化螟的種群遺傳多樣性進(jìn)行研究。
　　本文利用二化螟體內(nèi)已知的一條Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子序列片段，通過反向PCR和基因組步移等方法成功克隆獲得了一條完整的Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子序列，對該反轉(zhuǎn)座子序列進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究與分析。再者，對二化螟Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子序列中的天冬氨酰蛋白酶(AP)基因進(jìn)行了較系統(tǒng)

3、的研究與分析。最后，對二化螟體內(nèi)兩種類型轉(zhuǎn)座子序列的單堿基變異特點進(jìn)行了細(xì)致的比對分析。本文的研究，一方面使我們對二化螟Ty3/gypsy內(nèi)源性反轉(zhuǎn)座子的序列結(jié)構(gòu)特征等有了一個系統(tǒng)性的認(rèn)識;另一方面，通過對這兩種類型轉(zhuǎn)座子序列變異的研究，使對二化螟內(nèi)源性反轉(zhuǎn)座子序列的變異特點有了深刻的了解?？梢詫⑿驴寺～@得的二化螟Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子進(jìn)一步用于二化螟地理種群遺傳多樣性的研究，將二化螟種群發(fā)生與變異的生態(tài)因素和內(nèi)源分子遺傳因素相結(jié)合

4、，認(rèn)識與二化螟種群遺傳多樣性相適應(yīng)的分子形成機(jī)制。為闡明二化螟種群消長和爆發(fā)成災(zāi)的遺傳適應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　一、二化螟Ty31gypsy反轉(zhuǎn)座子的克隆與序列分析
　　基于二化螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的一條Ty3/gypsy類反轉(zhuǎn)座子序列片段，利用反向PCR和Genome Walking方法成功克隆出Ty3/gypsy類反轉(zhuǎn)座子的全長序列，命名為Csu-Ty3（GenBank登錄號:KJ191261）。該序列全長4939bp，在

5、基因組上插入的靶位點是“AACGT”，兩端的LTR不完全相同，5'端LTR長161 bp，3'端LTR長168bp，兩者的一致度為93.5％。經(jīng)ORF Finder分析，Csu-Ty3中包含三個獨立的ORF，從左到右依次編碼GAG蛋白、AP蛋白和一個多聚蛋白。Southern雜交顯示二化螟不同地理種群中均有較多的Csu-Ty3拷貝。在特定基因座位上，除了德陽和江津種群中有些個體在該位點上沒有檢測到Csu-Ty3拷貝的插入，其余種群中在該

6、位點上均含有Csu-Ty3拷貝的插入。
　　二、二化螟Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子天冬氨酰蛋白酶（AP）序列的克隆與分析
　　本文首次系統(tǒng)研究了二化螟Ty3/gypsy反轉(zhuǎn)座子的AP基因序列(GenBank:KF886014)。AP基因具有獨立的開放閱讀框，長528 bp，編碼的蛋白舍175個氨基酸殘基。該蛋白中含有一個特異的Asp_protease_2保守功能域。對同一基因座位上的AP序列多重比對分析，發(fā)現(xiàn)共存在46處堿基替

7、換，其中堿基轉(zhuǎn)換有31處，堿基顛換有15處，A→G的變異形式出現(xiàn)最多，有15處;其次是T→C的變異形式，有11處;其余的變異形式都很少，但絕大部分拷貝的ORF完整，能編碼完整的蛋白。
　　三、二化螟體內(nèi)兩種類型轉(zhuǎn)座子單堿基變異特點分析
　　利用多重序列比對分析軟件，分別對二化螟體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的DNA型轉(zhuǎn)座子和RNA型轉(zhuǎn)座子進(jìn)行獨立的多重序列比對分析，發(fā)現(xiàn)這兩種類型的轉(zhuǎn)座子序列在單個堿基的替換中表現(xiàn)出相似的特點。單堿基的轉(zhuǎn)換數(shù)均顯著