家蠶轉(zhuǎn)座子來源siRNA的鑒定與分析.pdf

1、小RNA是生物體生命活動(dòng)的重要調(diào)控因子，在生物的生長發(fā)育中發(fā)揮非常重要的作用。部分小RNA行使基因調(diào)控功能的過程依賴于Argonaute（AGO）蛋白等結(jié)合形成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），在RISC復(fù)合體的作用下小RNA能與靶基因結(jié)合并對(duì)靶基因進(jìn)行剪切或抑制其翻譯。因此，通常應(yīng)用免疫共沉淀AGO蛋白的方法將與之結(jié)合的小RNA及靶基因一起分離，再通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)

2、分析方法對(duì)這些RNA進(jìn)行分析，并通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，探究小RNA與調(diào)控靶基因之間的相關(guān)性。前期研究我們利用免疫共沉淀成功分離了長度為200nt以上的與BmAGO2結(jié)合的小RNA，并對(duì)其進(jìn)行了高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，分析發(fā)現(xiàn)BmAGO2結(jié)合的小RNA中，轉(zhuǎn)座子（Transposable elements，TEs）來源的小RNA占總RNA的47.78％。因此本研究通過Northern Blotting的方法對(duì)轉(zhuǎn)座子來源的小RNA進(jìn)行進(jìn)

3、一步鑒定與表達(dá)分析，并利用真核表達(dá)和RNA干擾(RNAi)方法上調(diào)和下調(diào)AGO蛋白，分析AGO蛋白上調(diào)和下調(diào)表達(dá)對(duì)TEs表達(dá)的影響，闡明RISC復(fù)合體對(duì)TEs的調(diào)控功能。
　　首先用生物學(xué)軟件將前期研究得到的BmAGO2結(jié)合小RNA與 BmAGO2結(jié)合的1,694條TEs進(jìn)行匹配，得到家蠶中TEs與小RNA的匹配圖譜，表明這些小RNA來源于TEs，命名為TEs來源小RNA（TE-siRNA），它們可能為類似于siRNA的新型小RN

4、A分子。合成小RNA特異探針，Northern Blotting鑒定桿狀病毒感染家蠶BmN細(xì)胞和正常BmN細(xì)胞中的TE-siRNA。檢測(cè)結(jié)果顯示，大部分TE-siRNA被成功檢測(cè)到，如TE-siRNA413、TE-siRNA610、TE-siRNA479、TE-siRNA649、TE-siRNA134和TE-siRNA671等，在這些被檢測(cè)出的TE-siRNA中，除TE-siRNA479外，其他小RNA均位于轉(zhuǎn)座子bm1645上，表明b

5、m1645可能為一個(gè)產(chǎn)生小RNA的“pool”。和正常細(xì)胞相比，部分TE-siRNA在桿狀病毒感染細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)，表明這些小RNA可能和病毒侵染相關(guān)，而部分TE-siRNA則維持了相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平。進(jìn)一步Northern Blotting鑒定正常和桿狀病毒感染五齡蠶、蛹、蛾三個(gè)時(shí)期中的TE-siRNA表達(dá)情況和正常卵中的TE-siRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在家蠶的不同生長時(shí)期均能檢測(cè)到部分TE-siRNA的表達(dá)，但各個(gè)時(shí)期檢測(cè)到的

6、TE-siRNA并不完全相同，表明某些TE-siRNA只存在于特定的家蠶生長發(fā)育時(shí)期，未檢測(cè)到的TE-siRNA也有可能由于含量太低導(dǎo)致信號(hào)弱而未被檢測(cè)出。TE-siRNA在家蠶發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)表明，其可能在家蠶特定的發(fā)育時(shí)期行使特定的基因調(diào)控功能，還有待進(jìn)一步研究。
　　和miRNA或siRNA通路相似，TE-siRNA和BmAGO2結(jié)合可能形成RISC復(fù)合物從而調(diào)控靶向TEs的表達(dá)。因此我們進(jìn)一步開展了BmAGO2過表達(dá)對(duì)T

7、Es基因轉(zhuǎn)錄水平影響的研究。轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)載體pIEX-1-BmAGO2到家蠶細(xì)胞中，qRT-PCR檢測(cè)表明成功上調(diào)BmAGO2基因的表達(dá)水平，同樣應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)此時(shí)細(xì)胞中TEs的轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果顯示，BmAGO2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)后可導(dǎo)致R1-3_BM、M19755、AK380858.1和Mariner-1-BM等轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)下調(diào)，而大量BmAGO2結(jié)合的TE-siRNA來源于這些下調(diào)的轉(zhuǎn)座子中，表明BmAGO2介導(dǎo)的R

8、ISC復(fù)合體可能結(jié)合TE-siRNA從而調(diào)控這些轉(zhuǎn)座子的表達(dá)，其機(jī)制可能類似于siRNA的基因調(diào)控通路，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外，我們還研究了Argonaute蛋白家族的其他兩個(gè)成員BmAGO3和BmSIWI的下調(diào)表達(dá)對(duì)TEs基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。應(yīng)用RNAi干擾技術(shù)，將體外合成的雙鏈RNA-BmAGO3-dsRNA和BmSIWI-dsRNA轉(zhuǎn)染到家蠶細(xì)胞中使細(xì)胞中BmAGO3和BmSIWI的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)此時(shí)

9、細(xì)胞中TEs轉(zhuǎn)錄水平的變化，結(jié)果顯示，BmAGO3基因的下調(diào)可導(dǎo)致bm1157、AK380858.1和R1-3_BM等轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生上調(diào)；而 BmSIWI基因的下調(diào)可導(dǎo)致 bm1157、AB480244.1、L1BM、AK380858.1、Mariner-1-BM、R1-3_BM和M19755等轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生上調(diào)，表明TE-siRNA分子可能和不同的AGO蛋白結(jié)合行使調(diào)控TEs的功能。
　　另外，我們還檢測(cè)了家蠶細(xì)胞中桿狀