鱗翅目昆蟲中piggyBac轉(zhuǎn)座子研究.pdf

1、piggyBac轉(zhuǎn)座子是典型的DNA轉(zhuǎn)座子，最初的序列在粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞系中分離(IFP2)。該轉(zhuǎn)座子目前已經(jīng)開發(fā)成為轉(zhuǎn)基因昆蟲中應(yīng)用最為廣泛的載體之一。雖然目前的研究工作已經(jīng)表明，piggyBac廣泛分布于各類生物的基因組中，但由于發(fā)生移碼突變或者缺失而使絕大多數(shù)序列結(jié)構(gòu)不完整，缺乏轉(zhuǎn)座活性。此外，與mariner等其他轉(zhuǎn)座子相比，piggyBac家族轉(zhuǎn)座子的生物學(xué)以及分子進(jìn)化研究仍然比較滯后，這種現(xiàn)狀與

2、piggyBac類轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)基因昆蟲和基因分離、功能分析研究中的重要地位不相稱。因此，本文對(duì)鱗翅目昆蟲的13個(gè)科的41種昆蟲展開了piggyBac類轉(zhuǎn)座子分布的調(diào)查，對(duì)夜蛾中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行全長(zhǎng)基因克隆，并對(duì)克隆獲得的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了活性測(cè)定和互作親和性分析，發(fā)現(xiàn)piggyBac轉(zhuǎn)座子末端和亞末端反向重復(fù)序列都是活性自主轉(zhuǎn)座子必需的元件。 1.鱗翅目昆蟲piggyBac轉(zhuǎn)座子的調(diào)查 采用簡(jiǎn)并引物PCR和Southern點(diǎn)

3、雜交技術(shù)篩查了鱗翅目的13個(gè)科，41種昆蟲中piggyBac因子的分布情況。結(jié)果顯示，夜蛾科的五種昆蟲被檢測(cè)到內(nèi)源性piggyBac因子的存在。這五種昆蟲分別是小地老虎(Agrotis ypsilon)，銀紋夜蛾(Argyrogramma agnata)，銀錠夜蛾(或稱為連紋夜蛾Macdunnoughia crassisigna)，斜紋夜蛾(Spodoptera litura)，瘦銀錠夜蛾(Macdunoughia confusa)。從

4、以上五種昆蟲基因組中克隆獲得的片斷長(zhǎng)350bp～380bp，經(jīng)Blast比對(duì)和序列分析，它們彼此之間以及與IFP2序列的相似性均在57％～97％不等。 2.piggyBac轉(zhuǎn)座子全序列的克隆 采用反向PCR和ITR PCR技術(shù)，從銀錠夜蛾，小地老虎和銀紋夜蛾三種昆蟲中成功克隆到相應(yīng)的piggyBac轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)，分別命名為 McrPLE，AyPLE和AaPLE。McrPLE全長(zhǎng)2472bp，編碼595個(gè)氨基酸，與IFP2序列

5、高度相似，一致性達(dá)99.5％。AyPLE1.1和AaPLE1.1分別編碼完整的598和600個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)座酶，兩者之間的相似性為79％，它們與IFP2轉(zhuǎn)座酶的相似性分別為59％和62％，屬于IFP2中度相似序列。而AyPLE1.2和AaPLE1.2兩個(gè)轉(zhuǎn)座子序列均積累了較大的變異，不能編碼完整轉(zhuǎn)座酶蛋白。此外，AyPLE和AaPLE兩類因子含有完全一致的反向末端重復(fù)序列，但都不存在亞末端反向重復(fù)。 3.piggyBac轉(zhuǎn)座子基因

6、的系統(tǒng)進(jìn)化分析 收集了14種生物的25個(gè)piggyBac類似因子的氨基酸序列，利用CLUSTALX1.8和MEGA3.1構(gòu)建親緣關(guān)系樹，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，進(jìn)化樹中piggyBac轉(zhuǎn)座酶大致分為三大支，即CladeI，CladeII和CladeIII。這三大支中都既包含昆蟲又包括哺乳動(dòng)物的piggyBac因子。本文所克隆的McrPLE，AyPLE1.1和AaPLE1.1都出現(xiàn)在CladeI中：McrPLE毗鄰IFP2；A

7、yPLE1.1，AaPLE1.1以及HaPLE1所在小分支與IFP2序列親緣關(guān)系最為接近，靴值高達(dá)100％。根據(jù)以上的進(jìn)化分析結(jié)果以及轉(zhuǎn)座子序列結(jié)構(gòu)特征推斷，AyPLE1.1，AaPLE1.1以及HaPLE1因子很可能是同一類新發(fā)現(xiàn)的piggyBac亞家族成員。此外，進(jìn)化樹信息還顯示不但在不同生物中可含有高度相似的piggyBac因子，而且轉(zhuǎn)座子序列與宿主進(jìn)化關(guān)系并不一致。以上結(jié)果揭示：piggyBac轉(zhuǎn)座子的進(jìn)化不僅僅遵循垂直遺傳的規(guī)

8、律，而且存在著生殖隔離物種間的水平轉(zhuǎn)移機(jī)制。 4.三個(gè)piggyBac類似因子轉(zhuǎn)座活性分析 在果蠅S2細(xì)胞中建立起轉(zhuǎn)座子活性檢測(cè)系統(tǒng)，研究了piggyBac類似因子McrPLE，AaPLE1.1和AyPLE1.1的功能。結(jié)果表明，McrPLE不但能夠在細(xì)胞中精確的剪切，而且能夠準(zhǔn)確地將KO α片段插入Target載體上的TTAA特異性位點(diǎn)。McrPLE因子的28個(gè)轉(zhuǎn)座事件分布于Target載體上可插入位點(diǎn)的85位

9、，101位，209位，363位，491位，603位，945位，992位和1863位，表現(xiàn)出插入位點(diǎn)的非特異性。AyPLE1.1的轉(zhuǎn)座酶不能識(shí)別缺少亞末端重復(fù)序列的pHa[KO α]Donor載體，但可以準(zhǔn)確剪切和轉(zhuǎn)座另一個(gè)加入IFP2的亞末端反向重復(fù)的pHB[KO α]Donor載體。結(jié)果表明，AyPLE1.1轉(zhuǎn)座酶是一個(gè)有功能的蛋白，并且亞末端反向重復(fù)序列在轉(zhuǎn)座酶識(shí)別以及剪切反應(yīng)中起著重要作用，一旦缺失就會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)座子的功能。AaP

10、LE1.1因子利用本研究采用的方法沒有檢測(cè)到活性檢，還有待進(jìn)一步研究。 5.piggyBac因子相互作用初探 利用果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，研究了兩類活性因子IFP2，McrPLE和AyPLE1.1之間互相識(shí)別和作用的關(guān)系。結(jié)果顯示，兩類轉(zhuǎn)座酶表現(xiàn)出很強(qiáng)的專一性，均只能識(shí)別各自的反向末端重復(fù)序列。根據(jù)該研究結(jié)果推測(cè)，反向末端重復(fù)序列很可能是決定轉(zhuǎn)座酶識(shí)別和作用專一性的重要序列，而亞末端反向重復(fù)則似乎沒有種類的特異性。

11、在剪切實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照中，偶然地發(fā)現(xiàn)pHB[KOα]Donor載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染果蠅細(xì)胞48小時(shí)后能檢測(cè)到不精確地剪切活動(dòng)，該結(jié)果暗示著果蠅S2細(xì)胞中的某個(gè)未知因子能夠與piggyBac轉(zhuǎn)座子載體互相作用，并有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析，對(duì)piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因安全性做出評(píng)估和鑒定。 綜上所述，本研究調(diào)查了鱗翅目中41種昆蟲內(nèi)源性piggyBac轉(zhuǎn)座子的分布情況，分離到一個(gè)IFP2高度相似的自主活性因子McrPLE，和一個(gè)編碼活性轉(zhuǎn)座

12、酶的非自主因子AyPLE1.1。轉(zhuǎn)座子互作研究表明，piggyBac轉(zhuǎn)座子的末端和亞末端反向重復(fù)序列都是構(gòu)成自主活性轉(zhuǎn)座子的必要元件，其中末端反向重復(fù)很可能決定著轉(zhuǎn)座酶識(shí)別和作用的專一性，而亞末端反向重復(fù)序列似乎沒有種類的特異性。 本文探索了在未知基因組生物中分離piggyBac轉(zhuǎn)座子的方法，為其他生物中克隆轉(zhuǎn)座子提供了可借鑒的手段；本研究深入了解了鱗翅目昆蟲內(nèi)源piggyBac轉(zhuǎn)座子的分布，分子進(jìn)化并探討了內(nèi)源性piggyBa