環(huán)境因子對(duì)斑馬魚轉(zhuǎn)座子活性的影響.pdf

1、近十多年來，表觀遺傳學(xué)研究越來越受到重視，人們對(duì)環(huán)境與基因組間存在互作的觀點(diǎn)逐漸認(rèn)同，但對(duì)環(huán)境與基因組互作機(jī)制的理解和認(rèn)識(shí)仍然比較模糊。轉(zhuǎn)座子從上世紀(jì)50年代被發(fā)現(xiàn)到開始的前幾十年一直被認(rèn)為是對(duì)基因組無用的垃圾序列，假基因。然而隨著越來越多的物種全基因組測(cè)序結(jié)果的揭示，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子是大多數(shù)生物基因組的重要組成成分，在基因組進(jìn)化和功能上發(fā)揮著重要的作用，且很多生物基因組中均存在著活性轉(zhuǎn)座子。因此，生物很可能通過基因組上的這些活性轉(zhuǎn)座子實(shí)

2、現(xiàn)基因組對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)，即環(huán)境變化影響轉(zhuǎn)座子活性，調(diào)控轉(zhuǎn)座的發(fā)生，進(jìn)而產(chǎn)生新的變異，適應(yīng)新的外界環(huán)境。然而，現(xiàn)有關(guān)于環(huán)境對(duì)轉(zhuǎn)座子活性影響的研究鮮有報(bào)道。本文通過生物信息學(xué)方法對(duì)9種硬骨魚基因組的轉(zhuǎn)座子成份進(jìn)行了注釋，進(jìn)行了物種間比較分析，并挖掘潛在的活性轉(zhuǎn)座子，在此基礎(chǔ)上以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分析部分代表性DNA和RNA轉(zhuǎn)座子的時(shí)空表達(dá)特性，并研究環(huán)境污染物包括二噁英類有機(jī)物(TCDD)和重金屬對(duì)這些轉(zhuǎn)座子活性的影響。主要結(jié)果如下:

3、r>　　1.通過生物信息學(xué)手段，使用RepeatModeler和LTRharvest、MGEScan-nonLTR等轉(zhuǎn)座子注釋軟件，對(duì)九種硬骨魚基因組轉(zhuǎn)座子進(jìn)行鑒定、識(shí)別和分類分析，最后結(jié)合篩除假陽性操作，分析結(jié)果表明九種硬骨魚基因組中分布著擴(kuò)增豐富的Ⅰ類和Ⅱ類轉(zhuǎn)座子，不同物種間擴(kuò)增情況差異顯著，且這種差異與基因組的大小存在一定的關(guān)聯(lián):在基因組較大的硬骨魚中，鑒定到的轉(zhuǎn)座子占基因組比例往往較大，如矛尾魚(2700Mb)中41.69％、斑

4、馬魚(1330Mb)中54.96％;在基因組較小的物種中，轉(zhuǎn)座子所占比例也較少，如金娃娃(347Mb)中占5.89％、紅鰭東方鲀(381Mb)中2.94％。轉(zhuǎn)座子的家族分化也極其豐富，在九種硬骨魚中鑒別出幾乎已知所有存在于硬骨魚上的轉(zhuǎn)座子家族。
　　2.為了研究轉(zhuǎn)座子的時(shí)空表達(dá)特征，將我們鑒定出的九個(gè)疑似活性轉(zhuǎn)座子代表包括:Tc1家族DNA轉(zhuǎn)座子(Tc-a、Tc-b、Tc-c、Tc-d、Tc-e)、反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座子(ZB-ERV-

5、1、ZB-ERV-2)、反轉(zhuǎn)錄LINE轉(zhuǎn)座子(L1-323、L1-21)的序列，合成引物用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè);分別收集斑馬魚早期發(fā)育節(jié)點(diǎn):0.75hpf、2hpf、3hpf、6hpf、15hpf、24hpf及48hpf的胚胎，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA;解剖12月齡成年斑馬魚，分別取出心臟、大腦、肌肉、肝臟、睪丸和卵巢，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，用上述引物研究轉(zhuǎn)座子在斑馬魚早期發(fā)育階段的mRNA水平變化及斑馬魚組織上的表達(dá)差異。結(jié)

6、果表明:早期發(fā)育階段DNA轉(zhuǎn)座子（除Tc-d外）在包括3hpf及之前的發(fā)育時(shí)期沒有檢測(cè)到mRNA的表達(dá)，后期呈現(xiàn)出一種先下降后上升的趨勢(shì)，而RNA轉(zhuǎn)座子隨著發(fā)育時(shí)間的延長一直呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì);在組織表達(dá)中，可以看出轉(zhuǎn)座子在大腦和心臟中的表達(dá)都要顯著高于其它組織，在睪丸中的mRNA表達(dá)水平最低。
　　3.為了研究環(huán)境應(yīng)激與轉(zhuǎn)座子活性水平的互作影響，收集斑馬魚胚胎孵育2h，用5nM的四氯二苯并-p-二惡英(TCDD)侵染胚胎兩小時(shí)，然

7、后換回新鮮的E3培養(yǎng)液培養(yǎng)到72h，收集胚胎，提取RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，以DMSO組為對(duì)照;使用Cu2+和Cd2+在斑馬魚受精0.5h時(shí)，分別以5μmol/L和30μmol/L的濃度誘導(dǎo)斑馬魚胚胎至24hpf,使用新鮮E3溶液繼續(xù)培養(yǎng)到72h，提取RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，使用上述合成的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，分別研究環(huán)境污染物二噁英(TCDD)和重金屬對(duì)生物體轉(zhuǎn)座子在mRNA水平活性的影響。結(jié)果表明，整體上TCDD抑制了轉(zhuǎn)座子（除ZB

8、-ERV-2外）的表達(dá)，其中四個(gè)Tc-1家族的DNA轉(zhuǎn)座子和一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座子顯著抑制。ZB-ERV-2在經(jīng)處理之后表達(dá)水平顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)座子活性經(jīng)過重金屬暴露實(shí)驗(yàn)之后，DNA轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平普遍上調(diào)，其中鎘處理使得Tc-b轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平下降，同時(shí)還抑制了3個(gè)RNA轉(zhuǎn)座子，對(duì)L1-323的表達(dá)具有顯著上調(diào)的作用，銅處理使得ERV轉(zhuǎn)座子(ZB-ERV-1，ZB-ERV-2)被抑制，其中ZB-ERV-1表達(dá)水平顯著下調(diào)，而LINE轉(zhuǎn)座子則被顯

9、著上調(diào)了表達(dá)。
　　總體上，本研究注釋了9個(gè)硬骨魚基因組中轉(zhuǎn)座子的分布情況，并進(jìn)行了不同物種間的比較分析，揭示了9種硬骨魚基因組上的轉(zhuǎn)座組差異，并在模式生物斑馬魚上系統(tǒng)研究了9個(gè)疑似活性轉(zhuǎn)座子的時(shí)空表達(dá)特征，分析了環(huán)境因子TCDD和重金屬暴露對(duì)斑馬魚早期胚胎的轉(zhuǎn)座子活性的影響。研究結(jié)果揭示了硬骨魚基因組中轉(zhuǎn)座子的分布情況和組成特征，為更好理解硬骨魚類的進(jìn)化關(guān)系提供了重要的參考，同時(shí)揭示了環(huán)境變化對(duì)基因組穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的可能分子機(jī)制