PB、SB和Tol2轉(zhuǎn)座子在斑馬魚中的基因轉(zhuǎn)移和基因捕獲效率比較研究.pdf

1、轉(zhuǎn)座子(Transposon，Tn)，是在生物界廣泛分布的，能夠在基因組上自主復(fù)制和轉(zhuǎn)移的一段DNA序列。轉(zhuǎn)座子能夠有效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)基因和基因捕獲等研究中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。目前已經(jīng)分離到很多高活性DNA轉(zhuǎn)座子，如PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子、Sleepingbeauty(SB)轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子等，并已經(jīng)在斑馬魚、小鼠、線蟲等模式生物的轉(zhuǎn)基因和基因捕獲等研究中得到廣泛應(yīng)用，但目前對(duì)PB、SB和Yol2轉(zhuǎn)座子在斑馬魚中的轉(zhuǎn)座

2、特性仍然缺乏深入了解。本研究系統(tǒng)比較了目前研究應(yīng)用最為廣泛的PB、SB和Tol2三種DNA轉(zhuǎn)座子在斑馬魚中的基因轉(zhuǎn)移和基因捕獲效率差異，為轉(zhuǎn)座子在相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供參考。本實(shí)驗(yàn)主要包括:
　　1、為比較PB、SB、Tol2轉(zhuǎn)座子的基因轉(zhuǎn)移效率差異，將含有鯉魚的beta-actin啟動(dòng)子（命名為FAG）和綠色熒光蛋白報(bào)告基因(Green Fluorecent Protein，GFP)表達(dá)盒(FAG-GFP)分別克隆至PB、SB

3、、Tol2轉(zhuǎn)座子框架內(nèi)，構(gòu)建成pPB-FAG-GFP、pSB-FAG-GFP、pTol2-FAG-GFP轉(zhuǎn)基因載體。然后將3個(gè)載體分別與SB，PB及Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA按照5個(gè)質(zhì)量比20ng∶10ng，20ng∶30ng，20ng∶50ng，20ng∶80ng，20ng∶100ng注射斑馬魚胚胎，獲得3個(gè)轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶最佳注射質(zhì)量比例。其中SB和PB為20ng∶50ng，Tol2為20ng∶30ng。再以最佳注射比例注射斑馬魚胚胎，分

4、別在48hpf和120hpf檢測(cè)的斑馬魚F0代胚胎的GFP陽(yáng)性率，結(jié)果表明:48hpf和120hpf檢測(cè)的斑馬魚胚胎中，Tol2的GFP陽(yáng)性分別為68％和68％(N=872)，高于PB（66％和68％，N=885）和SB（64％和65％，N=897），但三者差異不顯著(P＞0.05); F0代GFP陽(yáng)性個(gè)體飼養(yǎng)至成年后與野生型個(gè)體交配獲得F1代，對(duì)F1代的GFP檢測(cè)表明:Tol2組的生殖系傳遞效率最高為46.07％(NF0=231)，高

5、于PB組的17.86％(NF0=212)和SB組的13.41％(NF0=199)。
　　2、為比較PB、SB、Tol2轉(zhuǎn)座子的增強(qiáng)子捕獲效率差異，將含有斑馬魚krt4基因的基礎(chǔ)啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白報(bào)告基因(GFP)的表達(dá)盒(Krt4-GFP)分別克隆至3個(gè)轉(zhuǎn)座子框架中，構(gòu)建成:pPB-Krt4-GFP、pSB-Krt4-GFP、pTol2-Krt4-GFP增強(qiáng)子捕獲載體。將3個(gè)載體分別與SB，PB及Yol2轉(zhuǎn)座酶mRNA，按照上文

6、優(yōu)化的最佳比例注射斑馬魚胚胎，分別在48hpf和120hpf檢測(cè)斑馬魚F0代胚胎的GFP陽(yáng)性率，結(jié)果表明:Tol2組增強(qiáng)子捕獲效率最高，48hpf和120hpf時(shí)分別為90.45％和92.71％(N=1524)，顯著高于PB組(83.18％和83.32％，N=1276)，Tol2組在48hpf高于SB組(88.64％，N=1378)，但差異不顯著(P＞0.05)，在120hpf時(shí)顯著高于SB組(88.87％，N=1378)(P＜0.05

7、)。F0代GFP陽(yáng)性個(gè)體飼養(yǎng)至成年后與野生型個(gè)體交配獲得F1代，對(duì)F1代的GFP檢測(cè)表明:Tol2組生殖系傳遞效率最高達(dá)到55.56％(NF0=165)，高于PB組的32.56％(NF0=149)和SB組38.36％(NF0=151); F1代斑馬魚表達(dá)模式分布分析表明:Tol2能產(chǎn)生最多的單個(gè)表達(dá)模式的后代，PB則能產(chǎn)生更多表達(dá)模式的后代，SB趨于兩者之間。
　　3、為比較內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn)（Intemal Ribosome E

8、ntry Site，IRES）元件對(duì)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲效率的影響，將IRES元件插入pTol2-RG-Trap基因捕獲載體的PolyA捕獲構(gòu)件的下游，構(gòu)建成pTol2-GTrap。以不含IRES元件的pTol2-RG-Trap基因捕獲載體為對(duì)照，分別將pTol2-GTrap和pTol2-RG-Trap兩個(gè)載體與Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA，注射斑馬魚胚胎，分別在48hpf和120hpf檢測(cè)斑馬魚F0代胚胎的GFP陽(yáng)性率，結(jié)果表明:pTol2

9、-GTrap組在48hpf和120hpf的胚胎GFP陽(yáng)性率分別為74.93％和73.91％(N=986)，顯著高于pTol2-RG-Trap組(41.86％和41.04％，N=853)(P＜0.05)表明IRES元件能夠提高基因捕獲效率。
　　4、為比較PB、SB、Tol2轉(zhuǎn)座子的基因捕獲效率差異，以構(gòu)建成pTol2-GTrap為基礎(chǔ)，分別用PB和SB轉(zhuǎn)座子框架替換Tol2框架，構(gòu)建成pPB-GTrap和pSB-GTrap。將3個(gè)

10、載體分別與SB，PB及Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA，按照最優(yōu)比例注射斑馬魚胚胎，分別在48hpf和120hpf檢測(cè)斑馬魚F0代胚胎的GFP陽(yáng)性率，結(jié)果表明:Tol2組基因捕獲效率最高(74.93％和73.91％，N=986)，顯著高于SB組（66.07％和64.02％，N=1025）和PB組(54.23％和53.26％，N=976)，且SB和PB之間差異也達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。
　　綜上所述，本研究表明:在斑馬魚中，Tol2轉(zhuǎn)座