牡丹Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列的分離及其種質(zhì)資源評(píng)價(jià).pdf

1、牡丹（ Paeonia suffruticosa Andrews.）屬于芍藥科（ Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia L.）牡丹組（Sect. Mouton DC.）的木本植物，起源古老，是科學(xué)界公認(rèn)的比較原始被子植物之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在中國(guó)數(shù)千年栽培及自然選擇和人工引種下，牡丹已積累了豐富的遺傳多樣性資源，然而目前在牡丹上的研究多基于生理生化的水平上，利用反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等分子水平上對(duì)牡丹種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)的研究至今尚未

2、報(bào)道。本試驗(yàn)利用自己開(kāi)發(fā)的方法從牡丹基因組中分離出Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 LTR序列并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)地分析，最后根據(jù)分離出的LTR序列設(shè)計(jì)引物對(duì)牡丹進(jìn)行SSAP分子標(biāo)記試驗(yàn)，進(jìn)而進(jìn)行種質(zhì)資源評(píng)價(jià)，主要研究結(jié)果如下：
　　1.試驗(yàn)采用自主開(kāi)發(fā)的巢式 PCR方法分離牡丹 Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列并已申請(qǐng)專(zhuān)利。本試驗(yàn)使用一種結(jié)合了hiTAIL-PCR，抑制PCR及退火控制引物三種技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的方法，經(jīng)過(guò)2條嵌套引物

3、（RNase H1引物和RNase H2引物）結(jié)合改造后的ACP引物以及通用引物UP的三輪巢式PCR后，擴(kuò)增產(chǎn)物連接于載體并轉(zhuǎn)化、篩選、陽(yáng)性克隆鑒定后，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，從‘洛陽(yáng)紅’牡丹品種基因組DNA中成功分離出22條Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 LTR序列。這些序列中有20條含有 PPT及通用引物，經(jīng)過(guò)DNAstar等軟件將序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)這些序列在5端都有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守序列PPT，緊隨其后的03bp

4、有LTR序列的起始標(biāo)志TG（A），而在序列的3末端有UP通用引物序列。基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在RNase H保守區(qū)和軟件比對(duì)的結(jié)果，可以將這20條序列確定為牡丹Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列，登陸號(hào)分別為KC519444到KC519464。
　　2.試驗(yàn)利用iPBS方法從西北牡丹品種紅繡球‘和中原品種洛陽(yáng)紅‘中擴(kuò)增出目的條帶，經(jīng)回收，克隆，測(cè)序，獲得了12條來(lái)自牡丹LTR類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LTR序列，并使用DNAMAN、DNA

5、star和Vector NTI等相關(guān)序列分析軟件進(jìn)行序列分析后，發(fā)現(xiàn)這些序列兩端都有iPBS引物的存在，保守區(qū)域PBS后也可找到LTR序列的起始標(biāo)志TG（CA）。另外這些核苷酸序列表現(xiàn)出較高的異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為缺失突變，序列長(zhǎng)度變化范圍為313～894 bp，同源范圍從31.1％到65.8%不等。將其氨基酸序列與已登錄的不同植物L(fēng)TR類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR氨基酸序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明與其它某些植物具有一定的相關(guān)性，表明它們間可能存在著

6、LTR類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的橫向傳遞作用。
　　3.試驗(yàn)基于前兩個(gè)試驗(yàn)分離出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列的基礎(chǔ)上，在牡丹上開(kāi)發(fā)出SSAP（特異序列擴(kuò)增多態(tài)性；sequence-specific amplification polymorphism）分子標(biāo)記，并在牡丹種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析進(jìn)行研究，并對(duì)每組 SSAP引物單獨(dú)用于牡丹遺傳分析的性能作了探討。8個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子引物均根據(jù)試驗(yàn)1中分離的牡丹Ty1-copia類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列設(shè)計(jì)

7、合成，經(jīng)過(guò)與7個(gè)末端帶有3個(gè)選擇性堿基的Mse I或EcoR I接頭引物組合篩選后，使用可產(chǎn)生清晰豐富條帶的12對(duì)組合進(jìn)行SSAP標(biāo)記，在牡丹野生種、國(guó)外牡丹品種以及國(guó)內(nèi)不同地域牡丹品種共計(jì)151個(gè)牡丹種或品種中共擴(kuò)增出415個(gè)位點(diǎn)（多態(tài)位點(diǎn)92.77%）每對(duì)引物平均產(chǎn)生35個(gè)位點(diǎn)（33個(gè)多態(tài)位點(diǎn)），表明SSAP分子標(biāo)記是一種高多態(tài)性的標(biāo)記方法且在牡丹種質(zhì)資源分析具有較高的應(yīng)用價(jià)值；本試驗(yàn)還進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)后的品種、產(chǎn)地、花色分析，結(jié)

8、果表明多數(shù)來(lái)源地相同的牡丹品種表現(xiàn)出密切的親緣關(guān)系，然而也存在同一來(lái)源地的品種沒(méi)有聚類(lèi)一組的情況，花型花色等表面性狀與聚類(lèi)結(jié)果有一定聯(lián)系，但多數(shù)聚類(lèi)結(jié)果與性狀并未有一致的相關(guān)性，而聚類(lèi)結(jié)果與地域分布和進(jìn)化遠(yuǎn)近有較高的符合度。另外利用MCID（manual cultivar identification diagram）法將DNA標(biāo)記結(jié)果對(duì)151個(gè)牡丹樣本進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，僅用4對(duì)引物就能夠?qū)?51個(gè)牡丹樣本在分子水平上區(qū)分開(kāi)，所得的品