果梅LTR類逆轉(zhuǎn)座子序列特征及遺傳多樣性的SSAP分析.pdf

1、逆轉(zhuǎn)座子是廣泛存在于植物中的一類轉(zhuǎn)座元件,是目前已知數(shù)量最大的一類可活動(dòng)遺傳因子；具長末端(long terminal repeats,LTR)類逆轉(zhuǎn)座子主要可以分為Ty1—copia類和Ty3-gypsy類,其轉(zhuǎn)座的發(fā)生需以RNA為中介,采用“復(fù)制-粘貼”的方式進(jìn)行。因此,其引起的突變?yōu)榉€(wěn)定突變,對(duì)植物基因組大小、結(jié)構(gòu)、基因功能以及基因和基因組進(jìn)化等都有重要影響。
　　 果梅屬于薔薇科(Rosaceae)、李屬(Prunus

2、L.)、核果類果樹,起源于中國,具有悠久的栽培歷史,其果實(shí)不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,而且還有很好的保健作用。但是,關(guān)于果梅基因組中轉(zhuǎn)座元件的研究還未見報(bào)道,對(duì)果梅基因組中逆轉(zhuǎn)座子的含量、異質(zhì)性、分布和轉(zhuǎn)錄活性等的研究將有助于提高我們對(duì)其基因組的組成、結(jié)構(gòu)、進(jìn)化等方面的認(rèn)識(shí),從而有利于果梅基礎(chǔ)遺傳學(xué)研究,加快其育種進(jìn)程。
　　 本論文以‘甲州小梅’為試驗(yàn)材料,對(duì)其基因組內(nèi)Ty1-copia和Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)座子的異質(zhì)性、轉(zhuǎn)錄

3、活性、拷貝數(shù)等進(jìn)行了分析；同時(shí),利用基于砂Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子的SSAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)果梅不同種群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.以5個(gè)果梅品種的休眠枝韌皮部為材料,采用改良CTAB法提取基因組總DNA,并與其相應(yīng)幼葉的DNA提取效果進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明:該方法從5個(gè)果梅品種的休眠枝韌皮部中均能提取出基因組總DNA,且DNA的純度和完整性都較好,D260m/D280nm比值均在1.8～2.0之間

4、,無降解現(xiàn)象,RNA去除較干凈,能被限制性內(nèi)切酶完全消化；經(jīng)SSAP分析驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)韌皮部DNA的電泳表型與其相應(yīng)幼葉完全一致(引物組合為LTR-1/EcoR-ACC,LTR-2/EcoR-ACC),且均表現(xiàn)為條帶清晰,多態(tài)性好,表明此方法提取的果梅休眠枝韌皮部總DNA完全適于SSAP分析。
　　 2.用兼并引物通過普通PCR擴(kuò)增獲得了果梅基因組中Ty1-copia和Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)座子中逆轉(zhuǎn)錄酶的保守片段。Ty1-cop

5、ia和Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)座子的RT片段長度分別約為260和430 bp。序列分析表明:克隆得到的所有序列都富含AT堿基,其中Ty1—copia類AT/CrC是1.11—1.86,Ty3-gypsy類是1.01-1.95；在所獲得的62條Ty1-copia和40條Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)座子的RT序列中,分別含有32.3％和27.5％終止密碼子突變或(和)移框突變；且都具有高度的異質(zhì)性,其中Ty3-gypsy類低于Ty1-copia

6、類逆轉(zhuǎn)座子,其平均差異分別為45.3％和40.7％。聚類分析顯示,果梅中一些逆轉(zhuǎn)座子RT序列與其它物種的相似性明顯高于其自身序列彼此間的同源性。Southern點(diǎn)雜交分析表明,這兩類逆轉(zhuǎn)座子在果梅基因組中都以高拷貝形式存在,其中Ty1-copia類約7.9×103個(gè)拷貝,Ty3-gypsy類約1.0×104個(gè)拷貝,分別占基因組的18.4％和33.3％。雖然對(duì)果梅葉片經(jīng)過紫外光(UV),2,4-D及兩者的混合處理,但RT-PCR均未檢測(cè)到

7、有活性的逆轉(zhuǎn)座子,而dN/dS分析表明,果梅中的這兩類逆轉(zhuǎn)座子均具有潛在的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 3.本文通過對(duì)常規(guī)逆轉(zhuǎn)座子克隆方法的改進(jìn),成功地獲得了果梅Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子的RNase H-LTR序列,該方法具有可靠、高準(zhǔn)確率和低耗費(fèi)的特性。所分離的果梅11條序列的長度不等,其PPT結(jié)構(gòu)、IR中的序列組成也不盡相同；其中有5條序列的PPT結(jié)構(gòu)中存在著嘧啶堿基突變,且序列PmLTR6發(fā)生了重組突變。將這11條序列進(jìn)行聚類分析

8、發(fā)現(xiàn),所有序列可以分為三組。對(duì)果梅的11條序列的LTR區(qū)域進(jìn)行啟動(dòng)子分析,分別有10和9條序列中存在著“CAAT-box”和“TATA-box”的啟動(dòng)子元件,此外受光、熱、干旱、植物激素(脫落酸、赤霉素)調(diào)控的作用元件；PmLTR10還存在著在分裂組織和胚乳中特異表達(dá)的作用元件。從桃基因組中獲得了3條RNase H-LTR序列,這3條序列進(jìn)行聚類可以分為兩組,且其PPT、IR區(qū)域也不完全相同,其LTR區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)序列PpLTR1和PpL

9、TR3中含有受細(xì)胞分裂的調(diào)控的作用元件,在序列PpLTR1中還存在著受水楊酸調(diào)控的作用元件。
　　 4.利用從果梅基因組克隆到的3’-LTR序列,建立了適于果梅遺傳多樣性分析的SSAP分子標(biāo)記技術(shù)體系,結(jié)果表明在LTR引物3'端加一個(gè)選擇性堿基,可明顯增加多態(tài)性帶數(shù),退火溫度對(duì)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增無顯著影響:并利用此技術(shù)體系對(duì)60個(gè)果梅品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,在對(duì)所有果梅品種按其國家來源劃分并進(jìn)行群體遺傳多樣性分析時(shí),發(fā)

10、現(xiàn)中國的遺傳多樣性高于日本；按照產(chǎn)地劃分品種群,發(fā)現(xiàn)浙江江蘇地方品種群的遺傳多樣性最高,且存在著品種群特異變異；遺傳一致度分表明,4個(gè)品種群的親緣關(guān)系較近,其中浙江江蘇品種群和云南四川湖南地方品種群的一致度最高,其次為日本品種群和云南四川湖南品種群,分別為0.9687和0.9669,同時(shí)表明日本品種群和云南四川湖南地方品種群的遺傳分化較小,說明日本的果梅可能引自中國的西南地區(qū)。60個(gè)品種可分成5大組,但沒有明顯的紅梅類、青梅類和白梅類的