石刁柏Ty1-copia類反轉(zhuǎn)座子Aocrt4的克隆與分析.pdf

1、石刁柏是一種常見的雌雄異株植物，染色體組成為2n=20，具有一對處于進(jìn)化初期的同型性染色體XY，但是，至今尚未獲得確切的核型及同型性染色體直接的細(xì)胞學(xué)證據(jù)。石刁柏的染色體組具有不穩(wěn)定性特征。主要表現(xiàn)在，存在異型的常染色體對，B染色體數(shù)目不固定以及不同品種間的核型在著絲點位置和隨體位置方面有差異。故，石刁柏既是研究性染色體進(jìn)化、兩性植物起源和植物性別決定機(jī)制的模式植物，也是研究植物基因組和染色體組穩(wěn)定性的良好材料。
　　反轉(zhuǎn)座子是可

2、以在染色體間移動的DNA片段，其活動與基因組和染色體組的穩(wěn)定性、基因的表達(dá)、染色質(zhì)重塑等細(xì)胞學(xué)行為之間具有高度的相關(guān)性。
　　鑒于此，本文以石刁柏及其同屬的文竹為材料，利用PCR、RT-PCR、染色體原位雜交等技術(shù)，通過相關(guān)生物信息學(xué)的分析，對獲得的一個石刁柏反轉(zhuǎn)座子的序列特征、拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄活性及染色體定位進(jìn)行了研究，并對其在石刁柏染色體組進(jìn)化中的作用進(jìn)行了探討，為石刁柏染色體組的進(jìn)化提供基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下:
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3、、以石刁柏和文竹為材料，利用兼并引物對Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子進(jìn)行克隆和分析。結(jié)果顯示，從石刁柏及文竹基因組中均獲得了長約260bp的預(yù)期條帶。測序及序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列屬于Ty1-copia類反轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶基因保守區(qū)序列。
　　2、利用RT-PCR技術(shù)對Aocrt4及Ascrt1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，Aocrt4及Ascrt1在石刁柏雌雄轉(zhuǎn)錄組中均擴(kuò)增出陽性條帶，并且Aocrt4條帶的相對亮度在雌、雄石刁柏間無明顯

4、差別，說明該反轉(zhuǎn)座子仍具有轉(zhuǎn)錄活性，且雌雄性別間的轉(zhuǎn)錄活性沒有差異。結(jié)合高通量測序結(jié)果，對Aocrt4的拷貝數(shù)進(jìn)行估計發(fā)現(xiàn)，Aocrt4在石刁柏雌、雄基因組中的總拷貝數(shù)分別為2996和4572，每1C的拷貝數(shù)分別是558和589，這說明該反轉(zhuǎn)座子的分布與性別沒有明顯相關(guān)性。
　　3.為了分析Aocrt4是否具有種內(nèi)異質(zhì)性，本研究分別選擇石刁柏雌、雄各3株及文竹1株，用特異引物分別對這7個目標(biāo)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，對每個擴(kuò)增產(chǎn)物隨機(jī)挑選8

5、個單克隆進(jìn)行測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總共獲得的48個序列長度分布在244-245bp之間，平均相似度為97.72％，表現(xiàn)出較低的異質(zhì)性。雌雄間和同性別的不同株間序列的相似度沒有顯著的差異。通過對變異位點進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在48個序列中共有266個突變位點，除兩個位點是單堿基缺失外，其余均為堿基置換，且多為G/C(→)A/T。對石刁柏和文竹中的該反轉(zhuǎn)座子序列比較，發(fā)現(xiàn)其種間異質(zhì)性高于種內(nèi)異質(zhì)性。通過Aocrt4的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，該序列共編碼8

6、3個氨基酸，有12個序列發(fā)生了終止密碼子突變，突變位點集中在第47和48個氨基酸位置;2個氨基酸序列發(fā)生了移碼突變;在第43、49和73個氨基酸位置都分別存在兩種氨基酸，依次分別是組氨酸(H)/酪氨酸(Y)，組氨酸占85.2％;纈氨酸(V)/異亮氨酸(I)，纈氨酸占72.8％;異亮氨酸/蘇氨酸(T)，異亮氨酸占93.8％。除此之外，所有的氨基酸序列表現(xiàn)出了高度的保守性。
　　4、利用染色體原位雜交技術(shù)對Aocrt4進(jìn)行定位。結(jié)果發(fā)