RNA體外轉(zhuǎn)錄體系優(yōu)化.pdf

1、近幾十年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)RNA非編碼基因片段具有應(yīng)用在診斷和治療重大疾病方面潛在的商業(yè)價(jià)值。非編碼基因片段包括非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA）和編碼蛋白mRNA的非編碼區(qū)段（untranslated region,UTR）。非編碼RNA是所有不編碼蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄本的統(tǒng)稱，其代表是微小RNA(microRNA,miRNA)和長(zhǎng)非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）。在可編碼蛋

2、白mRNA上存在的非編碼區(qū)段代表是核糖開關(guān)（riboswitch）。
　　微小RNA是一類長(zhǎng)度介于18-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，研究表明人類編碼蛋白的基因中約30％受到miRNAs調(diào)控。它們參與基因的表達(dá)及調(diào)控、RNA加工及剪切和蛋白質(zhì)翻譯等生物學(xué)過(guò)程，強(qiáng)烈調(diào)控著生物的生長(zhǎng)和發(fā)育。長(zhǎng)非編碼RNA是一類長(zhǎng)度大于二百個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它們參與基因的表達(dá)及調(diào)控、RNA加工及編輯、蛋白質(zhì)翻譯、印跡調(diào)控和端粒系統(tǒng)的調(diào)控等，同時(shí)其自

3、身還可形成核酶或核糖開關(guān)。
　　核糖開關(guān)是一類能夠通過(guò)與代謝物小分子結(jié)合引起構(gòu)象變化而調(diào)控下游基因表達(dá)的mRNA分子。核糖開關(guān)在細(xì)菌中有著廣泛的分布，同時(shí)調(diào)控細(xì)菌體內(nèi)很多重要基因的表達(dá)過(guò)程，調(diào)控細(xì)菌的基本生命代謝和信號(hào)傳導(dǎo)。
　　通常對(duì)于生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究都是運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法達(dá)成。以RNA為例，其主要研究步驟包括：目的RNA獲得與純化、RNA結(jié)晶、衍射和相角數(shù)據(jù)的收集及處理修正，最后是結(jié)構(gòu)的描述和功能關(guān)系的研究。

4、從上述步驟可以看出，如何獲得轉(zhuǎn)錄量大、純度高的目的RNA是所有結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。
　　目前，有關(guān)運(yùn)用RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄生成RNA時(shí)有報(bào)道。但是，有關(guān)用于非編碼類RNA結(jié)晶的體外轉(zhuǎn)錄卻鮮有報(bào)道，特別是對(duì)晶體結(jié)構(gòu)模板體外轉(zhuǎn)錄的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)更是未見報(bào)道。
　　本文的立意點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)即在于選擇SAM-V核糖開關(guān)晶體結(jié)構(gòu)模板作為代表物，參考Doudna等報(bào)道的體外轉(zhuǎn)錄體系，對(duì)相關(guān)的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到一個(gè)較優(yōu)的用于非編碼類RNA結(jié)晶

5、的體外轉(zhuǎn)錄體系，從而提高目的RNA體外轉(zhuǎn)錄的效率。
　　選擇的優(yōu)化條件包括反應(yīng)時(shí)間、NTPs添加濃度和鎂離子添加濃度等幾個(gè)方面。每次只改變一個(gè)因素，初步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果用聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，并使用Bio-rad儀器對(duì)凝膠進(jìn)行拍照和分析，在相同背景下對(duì)所得條帶的RNA濃度進(jìn)行估算，得到目的RNA相對(duì)百分含量，繪得其變化趨勢(shì)圖。
　　其中有關(guān)反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果表明，目的RNA相對(duì)百分含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高，在8h

6、時(shí)達(dá)到最高值，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照體系目的RNA產(chǎn)率提高了50%；NTPs添加濃度的結(jié)果表明，目的RNA相對(duì)百分含量隨著NTPs添加濃度的提高而不斷提高，在添加濃度為4 mM/L時(shí)達(dá)到最高值，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照體系目的RNA產(chǎn)率提高了50%；鎂離子濃度的結(jié)果表明，目的RNA相對(duì)百分含量隨著Mg2+添加濃度的提高而不斷提高，在Mg2+添加濃度為85mM/L時(shí)達(dá)到最高值，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照體系目的RNA產(chǎn)率提高了將近80%。最后，將上述單項(xiàng)最優(yōu)條件組合成為RN