CD44單克隆抗體A3D8及其與阿糖胞苷聯(lián)合應(yīng)用在急性髓細(xì)胞性白血病中抗腫瘤機(jī)制的研究.pdf

1、白血病是造血干細(xì)胞異常的惡性疾病，白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生積聚并浸潤(rùn)其他器官和組織，同時(shí)使正常造血受抑制。根據(jù)白血病細(xì)胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性和慢性兩大類，其中急性白血病又可分為急性髓細(xì)胞性白血病(或急性粒細(xì)胞性白血病，acute myeloid leukemia，AML)以及急性淋巴細(xì)胞性白血病。AML隨著年齡的增長(zhǎng)其發(fā)病幾率也會(huì)隨之增高。盡

2、管AML發(fā)病率相對(duì)較低，但是每年僅美國(guó)就有約2.1％的癌癥病人死于該疾病。在我國(guó)，白血病的發(fā)病率為2.76/10萬(wàn)，占癌癥病人發(fā)病率2.6％左右，其中AML的發(fā)病率占絕大多數(shù)，約為1.5％。
　　 最初人們認(rèn)為黏附分子對(duì)于多細(xì)胞組織的形成以及聯(lián)系細(xì)胞與其細(xì)胞外機(jī)制(ECM)或臨近細(xì)胞等非常重要。CD44作為細(xì)胞表面的一種重要黏附分子，同時(shí)也是重要受體，其正常功能是介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的歸巢、淋巴細(xì)胞向炎癥部位和黏膜相關(guān)淋巴組織歸位、黏附

3、細(xì)胞外基質(zhì)等。但由于其在白血病細(xì)胞以及多種惡性瘤細(xì)胞表面都有不同程度表達(dá)，同時(shí)參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤轉(zhuǎn)移等多種作用，并且變異型CD44(CD44v)的高表達(dá)與惡性瘤的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，從20世紀(jì)末起，CD44已經(jīng)成為新型腫瘤療法的新靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的生成以及復(fù)發(fā)的過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)型CD44(CD44s)的表達(dá)量顯著增高。其它多種實(shí)體瘤如黑色素瘤、前列腺癌等也都高表達(dá)CD44。AML細(xì)胞表面同樣高表達(dá)CD44且不同AML

4、亞型細(xì)胞表面表達(dá)的CD44亞型也不盡相同。研究CD44的手段主要為單克隆抗體，已有研究發(fā)現(xiàn)，使用CD44單克隆抗體能夠誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化或者凋亡，并且使用低濃度單克隆抗體能夠改變AML細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，所以CD44單克隆抗體可以作為治療AML的一種手段。也有研究表明，使用小分子量HA或可溶性蛋白質(zhì)，同樣能夠阻斷某些由CD44傳導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)，從而抑制腫瘤的多藥耐藥性。并且，CD44不僅表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞表面，也高表達(dá)于腫瘤干細(xì)胞表面

5、，使用CD44單克隆抗體H90能明顯殺傷白血病干細(xì)胞。這些證據(jù)說(shuō)明，CD44在AML以及其它腫瘤發(fā)生發(fā)展以及治療中十分重要。
　　 除骨髓移植外，細(xì)胞分化療法是近些年來(lái)最常用且有效治療AML的方法。通過(guò)維甲酸破壞PML-rarα(15q22的早幼粒白血病基因PML和17q21的維甲酸受體基因rarα)的治療方法能夠有效地治療AML M3病人。但是，由于其他亞型的AML中并不表達(dá)PML-rarα，極大地限制了這種方法在AML中的應(yīng)

6、用。所以，找到治療其他AML亞型白血病的方法非常重要，殺傷AML細(xì)胞或者白血病干細(xì)胞是治療AML疾病的研究方向。由于AML細(xì)胞表面高表達(dá)CD44，故選擇性靶向CD44是治療AML的方法之一。CD44單克隆抗體A3D8具有多種治療AML的活性，包括抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化等。但是，迄今為止，除細(xì)胞分化外，A3D8其它抗腫瘤活性機(jī)制尚無(wú)定論，使其應(yīng)用始終停留在初始階段，所以研究A3D8的抗腫瘤機(jī)制并且將其應(yīng)用于臨床，對(duì)于研究CD44

7、以及治療AML至關(guān)重要。
　　 而且，作為治療AML的首選化療藥物，阿糖胞苷(Ara-c)在臨床已經(jīng)廣泛應(yīng)用于AML的治療，但是同時(shí)也對(duì)病人造成無(wú)法忍受的痛苦。通過(guò)A3D8靶向CD44提高阿糖胞苷靶向性以降低其用藥濃度以及縮短用藥時(shí)間，是解決這個(gè)問(wèn)題的理想方法。
　　 本課題主要針對(duì)CD44單克隆抗體A3D8對(duì)AML細(xì)胞周期的影響和引起細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制以及A3D8靶向何種CD44進(jìn)行研究，并進(jìn)一步研究A3D8提高阿糖胞

8、苷靶向性提高療效的機(jī)制，為AML的治療研究提供新思路。
　　 本課題的研究?jī)?nèi)容如下。
　　 1 CD44單克隆抗體A3D8對(duì)細(xì)胞周期影響的研究試驗(yàn)中通過(guò)使用不同濃度CD44單克隆抗體A3D8或透明質(zhì)酸(HA)處理AML細(xì)胞，用臺(tái)盼蘭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色后在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞在處理后的增殖情況以及細(xì)胞毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A3D8對(duì)不同亞型AML細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用，但是不同亞型抑制程度不一。但使用HA在同樣條件下處理并不

9、能引起AML細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 采用PI(碘化丙啶)對(duì)AML細(xì)胞DNA染色后使用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用A3D8處理后，AML細(xì)胞生長(zhǎng)周期停留于DNA合成期，而HA不能改變AML細(xì)胞周期。
　　 本課題使用Western blot方法檢測(cè)處理后AML細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種重要的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)Bid及P27在各種AML細(xì)胞株中表達(dá)量均有不同程度提高。然后通過(guò)電轉(zhuǎn)染敲除基因

10、的方法將相應(yīng)小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)入AML細(xì)胞內(nèi)，破壞相應(yīng)蛋白質(zhì)的功能。結(jié)果表明，A3D8產(chǎn)生的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用主要通過(guò)Bid及P27兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，且由于Bid位于P27的上游，轉(zhuǎn)錄后基因沉默試驗(yàn)(post-transcriptional gene silencingand aznsgene silencing，RNAi)同樣證明Bid沉默后同時(shí)能下調(diào)P27蛋白表達(dá)水平，反之則不能，故A3D8誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用是由Bid

11、調(diào)控的。
　　 將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離是研究相應(yīng)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中如何轉(zhuǎn)移的方法之一。試驗(yàn)主要是使用不同的細(xì)胞裂解液通過(guò)兩步不同強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后分步分離。本試驗(yàn)通過(guò)分離細(xì)胞核質(zhì)后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)A3D8處理后，Bid從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，說(shuō)明Bid的轉(zhuǎn)位對(duì)細(xì)胞周期影響十分重要。
　　 2 CD44單克隆抗體A3D8引起細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究(A3D8單獨(dú)以及與阿糖胞苷聯(lián)合用藥)試驗(yàn)中使用Annexin V法以及檢測(cè)DNA片段法測(cè)定

12、AML細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A3D8能夠在某些AML細(xì)胞如AML M2、M3中引起一定比例細(xì)胞凋亡(在NB4細(xì)胞以及SKNO-1中分別引起約30％、50％凋亡細(xì)胞)。
　　 采用Western blot方法檢測(cè)處理后AML細(xì)胞中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-8被激活，這說(shuō)明A3D8誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡作用主要通過(guò)死亡受體途徑調(diào)控，并且研究發(fā)現(xiàn)，CD44s表達(dá)量越高，細(xì)胞凋亡作用越明顯。試驗(yàn)中使用caspase-8

13、抑制劑能夠抑制約50％由A3D8引起的細(xì)胞凋亡，但是caspase-9抑制劑則不能抑制A3D8的凋亡作用，進(jìn)一步說(shuō)明此凋亡作用主要通過(guò)死亡受體途徑調(diào)控而不是線粒體途徑。
　　 使用共聚焦顯微鏡考察了細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)分布情況的變化，以及細(xì)胞膜上的脂質(zhì)筏與Fas在A3D8處理前后的相互作用。經(jīng)過(guò)A3D8處理過(guò)的AML細(xì)胞表面能夠使脂質(zhì)筏重新分布形成“帽狀”微域，并且使Fas同時(shí)轉(zhuǎn)位于脂質(zhì)筏，激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡死亡受體途徑中的重要蛋白質(zhì)c

14、aspase-8；并且，采用膽固醇破壞劑甲基化-β-環(huán)糊精(MCD)37℃下孵育30 min破壞脂質(zhì)筏，使用共聚焦顯微鏡觀察或Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCD破壞脂質(zhì)筏后，能夠抑制A3D8誘導(dǎo)的AML細(xì)胞凋亡作用，并且抑制caspase-8的活化，故我們認(rèn)為A3D8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通過(guò)細(xì)胞表面脂質(zhì)筏的重新分布活化死亡受體途徑而不是通過(guò)線粒體途徑。
　　 本研究還發(fā)現(xiàn)，阿糖胞苷(Ara-c)能夠誘導(dǎo)CD4s蛋白表達(dá)量的

15、升高是通過(guò)Mnk、eIF4E的活化實(shí)現(xiàn)的，從而使本身沒(méi)有CD44s表達(dá)的HL-60細(xì)胞經(jīng)過(guò)Ara-c處理后CD44s表達(dá)量升高。采用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A3D8與Ara-c聯(lián)合用藥同樣在細(xì)胞表面使脂質(zhì)筏重新分布形成“帽狀”結(jié)構(gòu)，說(shuō)明聯(lián)合用藥能夠有效擴(kuò)大A3D8的應(yīng)用范圍。即使某些AML細(xì)胞表面不表達(dá)CD44s，使用Ara-c后使CD44s表達(dá)量增加，達(dá)到擴(kuò)大應(yīng)用CD44療法的目的。然后通過(guò)電轉(zhuǎn)染敲除基因的方法將Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

16、質(zhì)(Fas-Associated protein withDeath Domain，F(xiàn)ADD)siRNA轉(zhuǎn)入AML細(xì)胞內(nèi)，破壞死亡受體通路，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD缺失后能夠有效抑制caspase-8的活化，從而抑制AML細(xì)胞凋亡，說(shuō)明脂質(zhì)筏激活的死亡受體途徑在此聯(lián)合用藥中十分重要。siRNA試驗(yàn)以及共聚焦顯微鏡結(jié)果證明，埃茲蛋白(ezrin)與脂質(zhì)筏的重新分布密切相關(guān)。ezrin缺失后同樣能夠抑制A3D8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋

17、亡作用。所以我們認(rèn)為，此聯(lián)合用藥通過(guò)ezrin調(diào)控脂質(zhì)筏重新分布形成“帽狀”結(jié)構(gòu)，從而激活死亡受體途徑，使AML細(xì)胞凋亡。通過(guò)此聯(lián)合用藥，能夠顯著降低Ara-c的使用劑量，減少用藥時(shí)間，同時(shí)增加其靶向性，從而降低Ara-c在治療白血病時(shí)對(duì)病人造成的痛苦。
　　 本研究取得的成果和結(jié)論：
　　 細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制是臨床化療藥物治療惡性瘤的重要方法。盡管在AML病人中已經(jīng)廣泛使用化療藥物達(dá)到治療該疾病的目的，但是化療藥

18、物選擇性差、對(duì)病人造成痛苦以及病人對(duì)藥物的多藥耐藥等問(wèn)題一直困擾著所有研究人員，并且由于無(wú)法選擇性殺傷白血病干細(xì)胞也是無(wú)法根治此疾病的原因之一。CD44雖然不是白血病干細(xì)胞表面上唯一受體，但是其與AML的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，所以選擇性靶向CD44或有希望成為治療AML的新方向。
　　 本論文取得的主要?jiǎng)?chuàng)新性成果與結(jié)論如下：
　　 (1)A3D8引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用是由bid進(jìn)行調(diào)控，且需要bid從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核中，從

19、而激活P27。
　　 (2)A3D8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用是由脂質(zhì)筏的重新分布形成“帽狀”結(jié)構(gòu)，從而激活Fas誘導(dǎo)的死亡受體途徑引起。
　　 (3)A3D8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要與CD44s表達(dá)量相關(guān)，表達(dá)量越高，細(xì)胞凋亡率越高。
　　 (4)Ara-c能夠活化Mnk、eIF4E，從而誘導(dǎo)CD44s蛋白表達(dá)量升高。
　　 (5)A3D8與Ara-c聯(lián)合用藥能夠提高A3D8的細(xì)胞凋亡作用，其機(jī)制與A3D8單獨(dú)用藥一