低劑量輻射及CD44單克隆抗體IM7對(duì)慢性髓細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞輻射敏感性及歸巢影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的和意義
　　 現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，白血病干細(xì)胞（Leukemic stem cells，LSCs）是白血病發(fā)生、維持的基礎(chǔ)，其95％以上的細(xì)胞處于G0期，對(duì)常規(guī)的放、化療多不敏感，成為白血病治療后殘留與復(fù)發(fā)的根源，因此白血病干細(xì)胞的根除是治療成功的關(guān)鍵。
　　 目前針對(duì)LSCs的靶向治療很多，但單一治療效果不太理想，因此有必要從多途徑、多種治療手段聯(lián)合應(yīng)用方面深入研究與探討，以提高靶向治療的療效。近年來(lái)，有研究證實(shí)白

2、血病干細(xì)胞必須歸巢及植入骨髓才能發(fā)揮其生物學(xué)特性。因此，人們就試圖通過(guò)特異性干擾LSCs細(xì)胞的歸巢、植入，從而改變LSCs的命運(yùn)。其中，細(xì)胞表面黏附分子CD44與多種惡性腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)化相關(guān)，因此受到研究者的關(guān)注。Krause等研究證實(shí)了表達(dá)BCR-ABL融合基因的LSCs歸巢和植入骨髓需要CD44分子的參與。
　　 LSCs細(xì)胞多處于休眠期，對(duì)常規(guī)照射劑量抗拒，非常規(guī)照射劑量成為研究熱點(diǎn)。低劑量照射（Low dose irrad

3、iation，LDR）因其具有免疫增強(qiáng)效應(yīng)、超敏感性、抗腫瘤效應(yīng)等倍受關(guān)注。但LDR的超敏感性，能否有效地殺滅化療后殘存的LSCs細(xì)胞；其免疫增強(qiáng)效應(yīng)能否有效地放大GVL效應(yīng)以清除LSCs細(xì)胞等，目前未見(jiàn)報(bào)道。
　　 基于上述的研究現(xiàn)狀以及我們的設(shè)想與推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)以表達(dá)BCR-ABL融合基因的LSCs細(xì)胞歸巢和植入過(guò)程需要CD44分子的參與，以及LDR的免疫增強(qiáng)效應(yīng)、超敏感性及抗腫瘤作用為切入點(diǎn)，研究抗CD44單克隆抗體LDR、

4、IM7單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)人CML-LSCs細(xì)胞輻射敏感性及歸巢的影響。研究目的在于為靶向治療人CML 干祖細(xì)胞提供新的治療策略與思路，并拓寬放射治療技術(shù)在白血病治療中的應(yīng)用。
　　
　　
　　 方法
　　 第一部分 取20例健康產(chǎn)婦臍血100ml，免疫磁珠法分離純化臍血CD34+干祖細(xì)胞作為對(duì)照組；取40例初診慢性髓細(xì)胞白血病慢性期患者骨髓液5-10ml，免疫磁珠法分離純化白血病CD34+干祖細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組

5、，克隆形成分析法測(cè)定兩種細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，采用多靶單擊模型和線性二次模型擬合細(xì)胞存活曲線，根據(jù)D0、Dq及α／β比值等放射生物學(xué)參數(shù)，比較兩種細(xì)胞的放射敏感性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞周期時(shí)相分布的差異性。
　　 第二部分 將上述兩種免疫磁珠法分離純化的CD34+細(xì)胞依據(jù)LDR劑量0cGy、12.5 cGy和50cGy分組，輻照后分別于24、48和72h收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)LDR對(duì)兩種干祖細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及凋亡率的影響；另于輻

6、照后24h收集細(xì)胞應(yīng)用Western Blotting檢測(cè)CML-CD34+細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)變化；RT-PCR、RQ-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中P16、DAPK1基因mRNA表達(dá)的變化。
　　 第三部分 將上述兩種免疫磁珠法分離純化的CD34+細(xì)胞與CD44單克隆抗體IM7孵育后，首先應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CML-CD34+細(xì)胞和臍血CD34+細(xì)胞CD44分子表達(dá)情況，再利用MTT法檢測(cè)IM7孵育前后兩種干祖細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力

7、的變化，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力的改變。
　　 第四部分 取20例初診的慢性髓細(xì)胞白血病慢性期患者的CML-CD34+細(xì)胞，利用Annexin-V試劑盒檢測(cè)CD44單克隆抗體IM7對(duì)CML-CD34+細(xì)胞凋亡的影響；RQ-PCR及RT-PCR檢測(cè)CML-LSCs中原癌基因C-myc、NF-κB表達(dá)狀況；Western-blot檢測(cè)IM7孵育后CML-CD34+細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié) 果

8、r>　　 第一部分 (1)臍血CD34+細(xì)胞和CML-CD34+細(xì)胞對(duì)射線均較敏感，呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系；（2）多靶單擊模型中，臍血CD34+細(xì)胞的SF2、D0、Dq值分別為0.3508、2.247、0.083，CML-CD34+細(xì)胞的 SF2、D0、Dq值分別為0.2972、1.828、0.037；（3）線性二次模型中，臍血CD34+細(xì)胞和CML-CD34+細(xì)胞的α／β值分別為4.577和7.879。（4）臍血CD34+細(xì)胞89.

9、9％處于G0/G1期，而CML-CD34+有50％的細(xì)胞處于G0/G1,44.5％的細(xì)胞處于DNA合成的S期，5.4％細(xì)胞分布于G2/M期，兩種細(xì)胞的周期分布總體差異有顯著性（P<0.05）。
　　 第二部分 (1）CML-CD34+細(xì)胞經(jīng)12.5cGy劑量處理后48h出現(xiàn)G0∕G1期阻滯，該劑量點(diǎn)72h出現(xiàn)G2/M期阻滯，50cGy劑量點(diǎn)照射后72h出現(xiàn)了G0∕G1期阻滯現(xiàn)象。（（2）CML-CD34+細(xì)胞經(jīng)LDR處理后，早期

10、凋亡率隨時(shí)間推移逐漸增加，50cGy劑量照射后72h處達(dá)到(17.75±11.76)％，與未照射組(6.13±4.71）％相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）CML-CD34+細(xì)胞經(jīng)12.5cGy劑量照射后P16 mRNA表達(dá)略上調(diào)，50cGy劑量照射后 P16 mRNA水平明顯增高（P＜0.01）。（4）LDR各劑量點(diǎn)照射后24h時(shí)，CML-CD34+細(xì)胞中P53蛋白的表達(dá)無(wú)明顯的變化，與對(duì)照組及各組間相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

11、P>0.05)。（5）CML-CD34+細(xì)胞經(jīng)輻照后DAPK1基因表達(dá)均上調(diào)（P＜0.01），以50cGy劑量點(diǎn)處上調(diào)最為顯著。（6）臍血CD34+細(xì)胞經(jīng)LDR各劑量點(diǎn)輻照后細(xì)胞周期分布、早凋亡率及凋亡相關(guān)基因、蛋白（P53蛋白、P16mRNA、DAPK1mRNA）均無(wú)明顯的變化(P>0.05)。
　　 第三部分 IM7對(duì)CML-CD34+細(xì)胞表面CD44 粘附分子陽(yáng)性識(shí)別率高達(dá)（86.6±2.10）％，熒光強(qiáng)度為（9.72±1

12、.02），而臍血CD34+細(xì)胞CD44 陽(yáng)性識(shí)別率僅為（25.4±1.70）％，熒光強(qiáng)度為（5.34±0.96），兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（(P<0.05)。（2）CML-CD34+細(xì)胞經(jīng)IM7孵育后，與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力顯著下降（570nm，OD值為0.34±0.07，對(duì)照組為 0.62±0.11，P<0.05）。（3）經(jīng)IM7孵育后CML-CD34+細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移能力明顯受到抑制，抑制率為46％-63％。（4）IM7孵育前后，

13、臍血CD34+細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的粘附能力及跨內(nèi)皮遷移能力均無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　 第四部分 經(jīng)IM7孵育后，CML-CD34+細(xì)胞的早期凋亡率（﹪）為12.58±2.84，與對(duì)照組（5.42±1.84）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CML-CD34+細(xì)胞原癌基因C-mycmRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量下降了65％，同時(shí)NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)活性明顯受到抑制。
　　

14、 結(jié) 論
　　 （1）CML-CD34+細(xì)胞及臍血CD34+細(xì)胞照射后亞致死損傷修復(fù)能力均較差，對(duì)射線均較敏感，但CML-CD34+細(xì)胞對(duì)射線的敏感性是臍血CD34+細(xì)胞的1.23倍，可能與兩者之間細(xì)胞周期時(shí)相分布有關(guān)。
　　 （2）LDR可特異性誘導(dǎo)CML-CD34+細(xì)胞輻射興奮效應(yīng)，刺激細(xì)胞周期的再分布，增加輻射敏感性，DNA輻射損傷通過(guò)非p53依賴途徑誘導(dǎo)激活p16基因、DAPK1基因，從而促進(jìn)CML-CD34+

15、細(xì)胞凋亡
　　 （3）CD44單抗IM7在體外能有效抑制CML-CD34+細(xì)胞的粘附和遷移，從而為白血病的靶向治療提供新的治療靶點(diǎn)與理論依據(jù)。
　　 （4）CD44單抗IM7能有效誘導(dǎo)CML-CD34+細(xì)胞凋亡，可能機(jī)制為IM7與細(xì)胞膜上CD44粘附分子受體結(jié)合后啟動(dòng)一系列異常信號(hào)通路，抑制了核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，C-myc及Bcl-2作為NF-κB下游效應(yīng)靶基因表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)CML-CD34+細(xì)胞的凋亡。

16、r>　　 綜上所述：本研究表明（1）CML-CD34+細(xì)胞及臍血CD34+細(xì)胞對(duì)射線均較敏感，但兩者之間的輻射敏感性的差異，可能與其細(xì)胞周期時(shí)相分布有關(guān)；（2）低劑量輻射可特異性引發(fā)CML-CD34+細(xì)胞的輻射興奮效應(yīng)，DNA輻射損傷通過(guò)非p53依賴途徑誘導(dǎo)激活p16基因、DAPK1基因，從而促進(jìn)CML-CD34+細(xì)胞凋亡；（3）抗CD44單抗IM7在體外不僅能有效抑制CML-CD34+細(xì)胞的粘附和遷移，而且還可以誘導(dǎo)CML-CD34