17-DMAG對缺氧腫瘤細胞輻射敏感性影響研究.pdf

1、目的:
　　 本課題應用氯化鈷建立體外人宮頸癌HeLa細胞的化學模擬缺氧模型,研究探討17-DMAG對缺氧條件下HeLa細胞輻射敏感性的影響,通過檢測不同濃度17-DMAG處理后細胞中的HIF-1α、HSP70蛋白表達情況；以及觀察17-DMAG聯合γ射線照射對缺氧處理后的HeLa細胞凋亡和細胞周期阻滯的影響,研究17-DMAG對缺氧條件下HeLa細胞輻射敏感影響自勺作用機理。
　　 方法:
　　 利用CoCl2

2、對HeLa細胞進行模擬缺氧處理,利用60Coγ射線對細胞進行照射,采用Western-Blot法檢測17-DMAG對模擬缺氧條件下HeLa細胞中HIF-1α和HSP70的表達；克隆形成法測定17-DMAG聯合射線照射對缺氧條件下HeLa細胞存活率的影響；通過激光共聚焦顯微鏡觀察17-DMAG聯合射線照射對缺氧條件下HeLa細胞凋亡的影響；應用流式細胞儀測定17-DMAG聯合射線照射對缺氧條件下HeLa細胞周期阻滯的影響。
　　

3、結果:
　　 (1)Western—Blot檢測17-DMAG對HIF-1α蛋白表達影響:經不同濃度的CoCl2作用24小時后,HeLa細胞中HIF-1α蛋白表達隨著CoCl2的濃度增加蛋白表達量不斷增強,在CoCl2濃度為200μmol／L時蛋白表達量最為明顯,因此我們選取濃度為200μmol／L的CoCl2對HeLa細胞進行模擬缺氧處理；應用不同濃度17-DMAG作用于CoCl2模擬缺氧處理的HeLa細胞,細胞中HIF-1α

4、蛋白隨著藥物濃度的增加,表達量逐漸降低,表明17-DMAG對HIF-1α蛋白具有表達抑制作用。同時觀察17-DMAG對HSP70蛋白的表達的影響,實驗結果顯示HSP70隨藥物濃度增加,表達量隨之而明顯增強,這與HSP90蛋白表達受到抑制而誘導HSP70表達有關。
　　 (2)克隆形成抑制實驗檢測HeLa細胞經γ射線照射后細胞存活率影響,結果顯示:17-DMAG預處理HeLa細胞,不同照射劑量組間的存活率差異具有顯著性(P<0.0

5、1)。正常對照組與單純缺氧組經不同劑量γ射線照射后細胞存活率相比較:單純缺氧組細胞的存活率高于正常對照組,即在缺氧環(huán)境下腫瘤細胞具有輻射抗拒性。缺氧藥物組(25nmol／L)濃度組細胞存活率分別為:91.11％、35.33％、12.91％、3.59％、0.4％,而缺氧藥物組濃度達到50nmol／L時,細胞存活率分別為83.89％、24.04％、6.54％、1.3％、0.08％。從劑量存活曲線中可以看出藥物照射組“肩區(qū)”明顯縮小變窄,直線

6、斜率部分增大,且各劑量點的存活率均低于單純缺氧組,這表明17-DMAG可以明顯增加缺氧條件下HeLa細胞的輻射敏感性。
　　 (3)17-DMAG對γ射線照射誘導缺氧條件下HeLa細胞凋亡影響,結果顯示:不同濃度17-DMAG對缺氧條件下HeLa細胞凋亡影響,正常對照組與單純缺氧組相比較,正常對照組早期凋亡率(4.33％)略高于單純缺氧組(1.56％),但統(tǒng)計學差異不明顯(P>0.05),而17-DMAG聯合(4Gy、8Gy)射

7、線照射對HeLa細胞凋亡影響中顯示,單純照射組早、晚期細胞凋亡率(17.22％、8.67％；36％、16％)明顯高于單純缺氧組(12％、4.22％；24.22％、8.44％),即在缺氧環(huán)境下的HeLa細胞對射線照射具有耐受性,可以保護HeLa細胞因射線導致的細胞凋亡。比較不同藥物濃度的17-DMAG預處理后經不同劑量γ射線照射的缺氧藥物組與單純缺氧組,結果顯示:隨藥物濃度的增加細胞早、晚期凋亡率明顯增加,并與照射劑量增高呈正相關,因此,

8、我們可以推測17-DMAG能夠促進輻射誘導的缺氧HeLa細胞凋亡。
　　 (4)17-DMAG聯合γ射線照射對缺氧條件下HeLa細胞的細胞周期分布影響結果顯示:單純藥物17-DMAG對HeLa細胞周期分布影響中,不同濃度17-DMAG處理的缺氧藥物組與單純缺氧組相比較,17-DMAG預處理對細胞周期各期均無影響(P>0.05)；單純缺氧組經不同劑量γ射線(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)照射24 h后G2／M期細胞量明顯增多,并

9、隨照射劑量的增加而不斷增高(22.02％,32.55％,42.35％,50.03％),即缺氧HeLa細胞經射線照射后出現G2／M期阻滯現象；而不同照射劑量中,17-DMAG對因照射而導致的G2／M期細胞阻滯有抑制作用,因此我們可以推斷,17-DMAG對HeLa細胞的輻射增敏作用機制可能與減少細胞G2／M阻滯有關。
　　 結論:
　　 (1)利用CoCl2處理細胞,可以誘導細胞HIF1-α過表達,熱休克蛋白90(HSP90

10、)的特異性抑制劑17-DMAG可以抑制模擬乏氧細胞的HIF1-α蛋白表達,同時由于抑制HSP90而導致HSP70過表達。
　　 (2)17-DMAG可以明顯降低γ射線照射后模擬乏氧細胞的存活率,表明:抑制HSP90可以提高乏氧細胞的輻射敏感性。
　　 (3)17-DMAG可以明顯提高γ射線照射后乏氧細胞的凋亡,并隨17-DMAG濃度越高,效應越明顯。
　　 (4)17-DMAG預處理并不改變乏氧細胞的周期分布；γ