調節(jié)急性髓系白血病干細胞對同種異體NK細胞殺傷的敏感性.pdf

1、成人急性髓細胞白血病(AML)是成人白血病的主要類型，占成人各種白血病的60％左右。雖然新型藥物的應用和治療方法的改進，使急性白血病的完全緩解率和5年生存率已有明顯的提高，但50％以上的患者仍然會復發(fā)。近年來，研究人員發(fā)現，造成白血病發(fā)生、治療中耐藥和白血病復發(fā)的根本原因是白血病患者體內存在著一群白血病干細胞(LSC)，白血病干細胞的發(fā)現為提高白血病治愈率找到了明確治療的靶標。大多數白血病干細胞處于CD34+CD38-CD123+發(fā)育階

2、段，可以根據其表面抗原進行分離純化。 但由于臨床上從白血病患者體內提取LSC受到許多方面的制約，影響了對LSC特性及治療的研究。腫瘤細胞株具有永生化的特性，可在體外培養(yǎng)長期生存，在動物體內形成腫瘤，因此推測腫瘤細胞株中可能存在腫瘤干細胞。FGRucker等使用DNA微陣技術，采用比較基因組雜交的方法，分析了17個髓系白血病細胞株，顯示髓系細胞株反應了內在原代細胞遺傳性的異常，支持細胞株代表了可靠和準確的模型系統(tǒng)。KG1A細胞株來

3、源于一男性AML患者，高表達CD34抗原，對粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子無反應，對柔紅霉素耐藥。因此我們擬在急性髓系白血病KG1A細胞株中尋找符合LSC表型的細胞，并對其分離及進行功能鑒定，以建立獲得數目較多的LSC的技術平臺。 研究發(fā)現LSC 95％處于G0期，對誘導凋亡的刺激不敏感，傳統(tǒng)的細胞周期化療藥對其無效，因此，單純依賴化療新藥物的開發(fā)和治療方案的改進，欲進一步提高CR率，延長緩解期和生存期是比較困難的。骨髓移植雖能延

4、長患者CR后的生存期，但限于供體來源和經濟條件，大面積推廣尚有困難。消滅殘留白血病細胞的另一重要途徑是通過免疫治療。 NK細胞是淋巴細胞譜系中不同于T、B淋巴細胞的一類大顆粒淋巴細胞，其代表性表型為CD56+、CD16+。它是天然免疫系統(tǒng)的主要效應細胞，無需抗原預先致敏，與靶細胞混合后4小時內即可發(fā)揮殺傷作用，表現為速發(fā)效應，因此位于機體抵御腫瘤和病毒感染的第一道防線，同時又能通過早期分泌多種細胞因子和趨化因子來調節(jié)獲得性免疫

5、，故也是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁，在機體免疫調節(jié)、造血調控、抗腫瘤和抗感染等方面發(fā)揮著重要的作用。體外研究顯示，同種反應性NK細胞對多種人類腫瘤細胞具有細胞毒活性：包括髓系白血病細胞、除普通型ALL以外的淋巴造血系腫瘤細胞。在前臨床模型中，將人類同種反應性NK細胞輸注到已植入人AML細胞的NOD/SCID(non-obesediabetic/severe combined immunodeficiency)小鼠體內，發(fā)現：未給予人

6、同種反應性NK細胞組小鼠均于3周內死亡；而輸入人同種反應性細胞組(即使輸入的細胞數很少)，這些同種反應性細胞即可清除白血病細胞并使小鼠存活120天。動物實驗及臨床移植均證實由KIR不相合產生的同種反應性NK細胞是allo-HSCT預后的有利因素。Miller等對一組接受大劑量環(huán)磷酰胺和氟達拉賓治療的腫瘤患者，在骨髓抑制期輸注來自HLA單倍體相合同胞供者的NK細胞，觀察到NK細胞在這些患者體內的擴增，并在具有KIR-配體不合供者組觀察到血

7、液學緩解。 本研究分四個部分，第一部分研究了Allo-NK細胞對急性髓系白血病KG1A細胞的殺傷活性及可能的機制；第二部分從KG1A細胞株中找到了符合LSC表型的細胞，并對其分離及進行功能鑒定，建立了獲得數目較多的LSC的技術平臺；第三部分探討Allo-NK細胞對LSCs細胞的殺傷活性；第四部分研究化療藥物在調節(jié)白血病干細胞對ALLO-NK殺傷敏感性中的作用。 研究目的和方法： 第一部分：ALLO-NK細胞對急性

8、髓系白血病KG1a細胞的殺傷效應 目的：觀察ALLO-NK細胞對急性髓系白血病細胞株KG1a的細胞毒效應，探討NK殺傷KG1a細胞的初步分子機制。 方法：免疫磁珠法分選CD3-CD56+的NK細胞，采用乳酸脫氫酶殺傷實驗(LDH)及甲基纖維素克隆形成檢測NK對KG1A細胞和K562細胞的殺傷率和克隆抑制率。用流式細胞儀KG1A細胞表面NKG2D配體MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表達情況及HLA-

9、I分子表達情況；RT-PCR檢測NKG2D配體在mRNA水平的表達，SSP法檢測KG1A細胞基因型，PCR檢測5例健康者的KIR分型。 第二部分：急性白血病KG1a細胞株中白血病干細胞的分離和鑒定 目的：分離和鑒定急性髓系白血病KG1a細胞中自血病干細胞 方法：免疫磁珠法分選KG1a細胞中CD34+CD38-細胞，FCM檢測其表面抗原、細胞周期、細胞分化功能。以甲基纖維素檢測其克隆形成能力，以NOD/SCID小鼠

10、為動物模型，尾靜脈接種CD34+CD38-細胞建立動物模型，以細胞形態(tài)學、細胞表面抗原、病理切片等方法鑒定模型；并連續(xù)轉種檢測其自我更新能力，證明分選出的CD34+CD38-細胞符合白血病干細胞的特性。 第三部分：ALLO-NK細胞對急性髓系白血病干細胞的殺傷效應 目的：探討同種異體NK細胞(CD3-CD16+CD56+)對急性髓系CD34+CD38-(LSC)的細胞殺傷效應，并與較之晚期階段的CD34+CD38+比較，

11、為NK細胞用于LSC的治療提供實驗依據。 方法： 免疫磁珠法分選CD34+CD38-細胞，乳酸脫氫酶殺傷實驗(LDH)及甲基纖維素克隆形成檢測NK對CD34+CD38-細胞的殺傷率和克隆抑制率。 第四部分：調節(jié)LSCs對ALLO-NK細胞殺傷的敏感性 目的：觀察不同藥物對作用LSCs細胞后其對NK細胞殺傷敏感性的影響，及克隆抑制率。 方法：選用LSCs細胞為研究對象，不同藥物(AS2O3、DNR、

12、MITO)與LSCs細胞37℃共孵育24小時，乳酸脫氫酶殺傷實驗(LDH)及甲基纖維素克隆形成實驗檢測NK對藥物作用后LSCs細胞的殺傷率及克隆抑制率，流式細胞儀分析NKG2D配體的變化。 結論： 1.Allo-NK對KG1a白血病群體細胞具有一定的殺傷活性，殺傷機制與供者NK細胞的KIR與KG1A的HLA-I分子基因型錯配有關。 2.KG1A細胞株中存在白血病干細胞，免疫磁珠法從KG1a細胞中分離白血病干細胞的

13、方法可靠。 3.分選出的LSCs大部分處于G0期，在體外可分化為LSCs和非LSCs，具有分化功能。 4.分選出的細胞在體外可形成克隆，在NOD/SCID小鼠體內可連續(xù)轉種形成白血病模型，具有自我更新功能。 5.體外實驗表明ALLO-NK細胞對白血病干細胞的殺傷率低，對非白血病干細胞殺傷率高，白血病干細胞抵抗NK細胞的殺傷。 6.AS2O3可上調CD34+CD38-細胞(LSCs)表面NKG2D配體ULB