Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)理研究.pdf

1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人急性白血病(acuteleukemia，AL)最常見(jiàn)的類型。盡管隨著化療方案的改善，AML完全緩解率(complete remission，CR)可達(dá)70％左右，仍有約20％的AML患者不能達(dá)到CR，屬于難治性病例，5年無(wú)病生存率極低。而即使初治CR患者大部分也會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，一旦復(fù)發(fā)，預(yù)后差。耐藥以及白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell，LSC)的存

2、在是AML難治及復(fù)發(fā)的根本原因。目前難治復(fù)發(fā)AML的治療仍比較困難，目前難治復(fù)發(fā)AML的治療仍比較困難，尚缺乏理想治療方案。
　　Vγ9Vδ2T細(xì)胞是近年來(lái)倍受關(guān)注的T細(xì)胞亞群之一，已證實(shí)其具有廣泛的特異性抗腫瘤作用。Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷腫瘤不具M(jìn)HC限制性，容易在體內(nèi)或體外進(jìn)行大量擴(kuò)增，且已在多種晚期實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)中初步顯示出較好的安全性與療效?；谏鲜龌A(chǔ)，我們推測(cè)Vγ9Vδ2T細(xì)胞治療可能為難治復(fù)發(fā)AML的治療開(kāi)辟新的方

3、向。
　　基于以上目的，我們擬解決以下三個(gè)科學(xué)問(wèn)題:一、明確Vγ9Vδ2T細(xì)胞是否可以在體內(nèi)外殺傷AML細(xì)胞，尤其是難治耐藥細(xì)胞;二、明確Vγ9Vδ2T細(xì)胞識(shí)別及殺傷AML細(xì)胞以及難治耐藥細(xì)胞的機(jī)制;三、探索聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑優(yōu)化對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的合理方案。
　　本研究通過(guò)以下三部分研究?jī)?nèi)容闡明上述科學(xué)問(wèn)題:
　　第一部分、Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞的殺傷作用研究
　　我們首先以A

4、ML亞型細(xì)胞株Kasumi-1、K562、NB4及HL-60為代表，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)AML細(xì)胞的殺傷作用呈效靶比（efficacy to target ratio，E/T）依賴性及時(shí)間依賴性增強(qiáng)趨勢(shì);Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)不同類型AML細(xì)胞的殺傷敏感性存在較大差異:對(duì)Kasumi-1細(xì)胞株殺傷作用最強(qiáng)，對(duì)K562及NB4細(xì)胞株殺傷作用中等，對(duì)HL-60細(xì)胞株殺傷作用極弱;與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokinesinduced

5、killer cells，CIK)為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)Kasumi-1、K562及NB4細(xì)胞的殺傷率無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　為研究Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)難治耐藥AML細(xì)胞的殺傷作用，我們以P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)高表達(dá)的蒽環(huán)類耐藥細(xì)胞株K562/AO2、HL-60/ADR及維甲酸受體（retinoic acid receptor，RAR）突變的維甲酸耐藥細(xì)胞株NB4/R1為代表，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)其殺傷

6、率與其來(lái)源的親本株以及耐藥性無(wú)明顯相關(guān);進(jìn)一步收集了11例臨床難治耐藥AML病人的骨髓標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)其骨髓原始細(xì)胞以及CD34+LSC也具有一定的體外殺傷作用，然而在E/T＜200∶1時(shí)，實(shí)際殺傷作用并不顯著;以正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells，BMMC)及正常成纖維細(xì)胞為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞均無(wú)顯著殺傷作用;
　　為研究Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)難治耐藥AML細(xì)胞的

7、體內(nèi)殺傷作用，我們以K562/AO2耐藥細(xì)胞株為代表，構(gòu)建了NOD/SCID小鼠人源化耐藥AML模型，發(fā)現(xiàn)唑來(lái)膦酸和IL-2聯(lián)合Vγ9Vδ2T細(xì)胞治療組與對(duì)照組及單用唑來(lái)膦酸和IL-2治療組比較，體重?zé)o明顯減輕，腫瘤負(fù)荷顯著降低，生存時(shí)間延長(zhǎng)。
　　本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Vγ9Vδ2T細(xì)胞可在體內(nèi)外水平殺傷AML細(xì)胞，包括難治耐藥細(xì)胞。Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)耐藥細(xì)胞的殺傷率與來(lái)源的親本株以及耐藥性無(wú)明顯相關(guān)。
　　第二部分、Vγ

8、9Vδ2T細(xì)胞識(shí)別及殺傷人急性髓系白血病細(xì)胞的機(jī)制研究
　　我們首先以Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)的Kasumi-1細(xì)胞株為研究對(duì)象，通過(guò)高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)觀察Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷AML細(xì)胞過(guò)程的動(dòng)態(tài)行為，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞與Kasumi-1共同孵育1h后，Vγ9Vδ2T細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生明顯變異，伸出偽足，在共同孵育2h后，Vγ9Vδ2T細(xì)胞上出現(xiàn)捕獲Kasumi-1細(xì)胞膜的熒光融合信號(hào);流式細(xì)胞術(shù)分析驗(yàn)證了Vγ9Vδ2T細(xì)

9、胞捕獲Kasumi-1細(xì)胞膜現(xiàn)象;共聚焦顯微鏡觀察到兩者共同孵育4h后，Kasumi-1細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)。
　　為明確Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷AML細(xì)胞的機(jī)制，我們將Vγ9Vδ2T細(xì)胞與Kasumi-1、K562、HL-60細(xì)胞株、耐藥株K562/AO2以及2例難治耐藥AML病人骨髓原始細(xì)胞共同孵育4h，發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD107a的Vγ9Vδ2T細(xì)胞比例顯著增加，伴刀球霉素A（ConcanamycinA，CMA）阻斷CD107a表達(dá)

10、后，Vγ9Vδ2T細(xì)胞的殺傷率明顯減低;使用FasL阻斷型抗體阻斷Fas與FasL作用途徑后，Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)Kasumi-1及NB4細(xì)胞的殺傷率無(wú)明顯變化;將Vγ9Vδ2T細(xì)胞與Kasumi-1、NB4細(xì)胞株共同孵育8h后發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)液上清中分泌型TNF-α(secreted TNF-α，sTNF-α)的水平明顯增加，但使用TNF-α阻斷型抗體阻斷TNF-α與TNF-α受體作用途徑后，Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)Kasumi-1及NB4細(xì)胞

11、的殺傷率無(wú)明顯變化;將Vγ9Vδ2T細(xì)胞與K562細(xì)胞以及耐藥株K562/AO2共同孵育5～20分鐘即可有效引起細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)分子磷酸化，對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷作用極弱的HL-60細(xì)胞則無(wú)明顯的ERK磷酸化現(xiàn)象;使用PD98059阻斷ERK通路及使用LY294002阻斷ERK上游Akt通路后顯著減弱Vγ9Vδ2T細(xì)胞與K562及K562/AO

12、2共同孵育4h后CD107a的表達(dá)，對(duì)HL-60細(xì)胞無(wú)顯著作用。
　　為進(jìn)一步了解Vγ9Vδ2T細(xì)胞識(shí)別AML細(xì)胞的機(jī)制，我們通過(guò)阿托伐他汀阻斷TCR配體異戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)在Kasumi-1、K562、NB4細(xì)胞株及耐藥株K562/AO2中的合成，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)上述細(xì)胞4h殺傷作用明顯減低;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞表面高表達(dá)NKG2D、CD11a、CD2

13、26三個(gè)殺傷相關(guān)受體分子;NKG2D的配體MICA/B、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-4，CD11a的配體ICAM-1、ICAM-2以及CD226的配體Nectin-2、PVR在上述不同AML細(xì)胞株及耐藥細(xì)胞株中表達(dá)水平各異，Kasumi-1細(xì)胞表達(dá)以上所有相關(guān)配體;上述配體的表達(dá)在耐藥株與其來(lái)源的親本敏感株之間也存在較大差異;通過(guò)線性回歸模型進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)其中ULBP-4及Nectin-2的表達(dá)水平與V9Vδ2T細(xì)胞對(duì)其殺

14、傷作用存在密切相關(guān)性;使用阻斷型抗體阻斷NKG2D后發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)表達(dá)ULBP-4的Kasumi-1細(xì)胞株4h殺傷率顯著減低;對(duì)不/低表達(dá)ULBP-4的細(xì)胞株K562、NB4及耐藥株K562/AO2細(xì)胞株無(wú)明顯變化;阻斷CD226后發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)表達(dá)Nectin-2的細(xì)胞株Kasumi-1、K562、NB4及耐藥株K562/AO2的4h殺傷率均顯著減低;阻斷CD11a后發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)表達(dá)ICAM-1/2的細(xì)

15、胞株Kasumi-1、K562、NB4及耐藥株K562/AO2的4h殺傷率大部分無(wú)顯著變化。
　　本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷AML細(xì)胞依賴細(xì)胞間直接接觸及細(xì)胞膜捕獲作用，通過(guò)激活ERK通路磷酸化，觸發(fā)穿孔素、顆粒酶作用途徑，使靶細(xì)胞在4h內(nèi)發(fā)生凋亡。TCR-IPP、NKG2D-ULBP-4及CD226-Nectin-2識(shí)別途徑可能參與了Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)AML細(xì)胞的殺傷機(jī)制。Vγ9Vδ2T細(xì)胞的殺傷作用與細(xì)胞類型

16、及耐藥性無(wú)關(guān)，與AML細(xì)胞表面配體ULBP-4及Nectin-2的表達(dá)水平有關(guān)。
　　第三部分、聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑優(yōu)化Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增方案的合理性研究
　　我們首先檢測(cè)了臨床引起慢粒細(xì)胞凋亡IC50濃度及臨床血藥峰濃度的伊馬替尼、尼洛替尼、達(dá)沙替尼對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效率的影響。發(fā)現(xiàn)只有達(dá)沙替尼IC50濃度的誘導(dǎo)不僅顯著增加了Vγ9Vδ2T細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增的數(shù)量，同時(shí)保持了理想的誘導(dǎo)比例。為明確三種T

17、KI對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞增殖活化的影響，我們檢測(cè)了Vγ9Vδ2T細(xì)胞表面增殖活化分子CD69、HLA-DR及CD25的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)只有達(dá)沙替尼IC50濃度可增強(qiáng)Vγ9Vδ2T細(xì)胞增殖活化分子CD69、HLA-DR的表達(dá)，與之前增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。CD25分子在各組均無(wú)顯著差異。我們還檢測(cè)了Vγ9Vδ2T細(xì)胞表面與活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)的分子Fas的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼IC50組及達(dá)沙替尼峰濃度組顯著下調(diào)了Fas的表達(dá)水平。
　　由

18、于在以上三種TKI中發(fā)現(xiàn)只有達(dá)沙替尼在IC50即10nmol/L濃度時(shí)可顯著增加Vγ9Vδ2T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效率，而在峰濃度即200nmol/L時(shí)反呈抑制作用，表明不同濃度的達(dá)沙替尼對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增作用可能有明顯差異。為摸索達(dá)沙替尼誘導(dǎo)Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外擴(kuò)增的最佳方案，我們進(jìn)一步用濃度梯度的達(dá)沙替尼進(jìn)行Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的增殖能力以及對(duì)AML細(xì)胞的殺傷功能進(jìn)行系統(tǒng)研究。發(fā)現(xiàn)達(dá)沙

19、替尼在10 nmol/L濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的絕對(duì)數(shù)量，其中在2umol/L時(shí)擴(kuò)增的數(shù)量達(dá)到頂峰，而在大于10nmol/L濃度時(shí)呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用;達(dá)沙替尼在10 nmol/L濃度范圍內(nèi)可維持理想的Vγ9Vδ2T細(xì)胞誘導(dǎo)比例，而在大于10 nmol/L濃度時(shí)呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用;濃度梯度的達(dá)沙替尼誘導(dǎo)后Vγ9Vδ2T細(xì)胞的脫顆粒作用均較對(duì)照組增強(qiáng)，并且這種增強(qiáng)作用隨達(dá)沙替尼濃度的增加呈現(xiàn)逐漸降低復(fù)上

20、升的趨勢(shì);達(dá)沙替尼對(duì)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的脫顆粒增強(qiáng)作用可能與增強(qiáng)其CD27-效應(yīng)型亞群的比例有關(guān)，且在較低劑量時(shí)主要以誘導(dǎo)CD27-CD45RA-亞群比例增加為主，在較高劑量時(shí)以誘導(dǎo)CD27-CD45RA+亞群比例增加為主。
　　本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合適劑量范圍內(nèi)的達(dá)沙替尼可通過(guò)上調(diào)增殖活化分子表達(dá)增強(qiáng)Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外誘導(dǎo)的效率，下調(diào)Fas表達(dá)保持誘導(dǎo)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的活力，并通過(guò)增強(qiáng)其CD27-效應(yīng)型亞群的比例增強(qiáng)Vγ9

21、Vδ2T細(xì)胞對(duì)AML細(xì)胞的脫顆粒作用，對(duì)優(yōu)化目前Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方案具有合理性。
　　綜上，本研究證實(shí)了Vγ9Vδ2T細(xì)胞可殺傷AML難治耐藥細(xì)胞，系統(tǒng)揭示了Vγ9Vδ2T細(xì)胞識(shí)別及殺傷AML細(xì)胞的分子機(jī)制，進(jìn)一步闡明聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼可優(yōu)化目前Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方案。本研究可為難治耐藥AML的治療開(kāi)辟新的思路，為豐富Vγ9Vδ2T細(xì)胞抗腫瘤生物學(xué)行為的認(rèn)識(shí)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為優(yōu)化目前Vγ9Vδ