CDK抑制劑SNS-032對急性髓系白血病的殺傷作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性髓細胞白血病（AML）是造血細胞惡性克隆性病變，其特點是白血病細胞在骨髓顯著增生，抑制正常造血。成人AML的發(fā)生率明顯高于急性淋巴細胞白血病，是最常見的急性白血病;并隨年齡的增長而增加。目前采用聯(lián)合化療、造血干細胞移植等手段延長患者生存期，但仍有很大一部分患者無法耐受大劑量化療副作用，或使用常規(guī)藥物無效，最終復(fù)發(fā)。惡性腫瘤靶向藥物研究是白血病治療研究領(lǐng)域的熱點，目前已有多種小分子抑制劑治療AML進入臨床研究。細

2、胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)在調(diào)控細胞周期和基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用，AML常有CDK活性異常增高，因此CDK抑制劑可能在治療AML中發(fā)揮重要作用。
　　目的：
　　1、研究CDK抑制劑SNS-032在體外對AML細胞株的生長抑制作用;
　　2、研究小分子抑制劑SNS-032對AML細胞的誘導(dǎo)凋亡作用;
　　3、研究白細胞介素6能否逆轉(zhuǎn)SNS-032對AML的殺傷作用，從而克服耐藥;
　　4、通過基因芯片和蛋

3、白印跡實驗研究SNS-032對白血病細胞殺傷的分子機制。
　　方法：
　　1、臺盼藍染色法檢測細胞活性。收集藥物處理后的細胞，臺盼藍染色后，通過顯微鏡下直接計數(shù)，就可以對細胞存活率進行比較精確的定量。
　　2、應(yīng)用MTT法，檢測SNS-032對白血病細胞株生長抑制作用。
　　3、應(yīng)用流式細胞儀，檢測SNS-032作用后白血病細胞的凋亡情況。
　　4、基因芯片分析miRNA，檢測SNS-032作用前后micr

4、oRNA（miRNA）表達水平。
　　5、應(yīng)用Western blot，檢測SNS-032作用后JAK2/STAT3蛋白和CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc表達情況以及IL-6對試驗組JAK2/STST3蛋白表達的影響。
　　6、統(tǒng)計分析，應(yīng)用Prime4軟件統(tǒng)計，比較采用Dunnett-t法。
　　實驗結(jié)果：
　　1、 SNS-032對人AML不同細胞株的生長抑制作用:我們采用臺盼藍染色，通過人AML細

5、胞株用藥前及不同濃度下用藥24h、48h后的拒染率分析，闡述不同人AML細胞株對SNS-032作用的反應(yīng)。SNS-032濃度分別為25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L，結(jié)果顯示，SNS-032對各細胞株均有生長抑制作用，且呈濃度依賴性;其中MV4-11、U937細胞株生長抑制尤為明顯,MV4-11細胞株24小時100nmol/L藥物作用后平均拒染率為67.3％，48小時拒染率為53％，U937細胞株24小時100nmo

6、l/L藥物作用后平均拒染率為71.7％，48小時拒染率為53.4％。
　　2、 SNS-032對人AML細胞株的誘導(dǎo)凋亡作用:采用流式細胞儀檢測不同濃度SNS-032(100nmol/L、200nmol/L)作用于人AML細胞株24h，細胞的數(shù)量百分比變化，結(jié)果顯示，SNS-032為100nmmol/L時，細胞凋亡率達12.1％，當(dāng)SNS-032為200nmmol/L時凋亡率達59.4％，提示凋亡細胞呈濃度依賴性。
　　3、

7、 SNS-032對人AML細胞株miRNA的影響:應(yīng)用microRNA(miR)芯片分析SNS-032作用前后miR的差異表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNS-032顯著下調(diào)miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、miR-106a、miR-17、miR-378c的表達水平，顯著上調(diào)has-miR-320a。
　　4、SNS-032對JAK/STST3途徑相關(guān)蛋白的抑制作用

8、:應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測SNS-032對JAK/STAT3蛋白表達的作用，結(jié)果顯示SNS-032顯著抑制JAK蛋白表達，抑制STAT3的磷酸化水平。此外，SNS-032對CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc也有顯著的抑制作用。
　　5、(5)IL-6對SNS-032對白血病細胞作用的影響:應(yīng)用Western-blot技術(shù)，對試驗組聯(lián)合IL-6進行分析，發(fā)現(xiàn)IL-6在HL-60細胞組可輕度上調(diào)JAK2和磷酸化ST

9、AT3，但不能逆轉(zhuǎn)SNS-032對其的抑制作用，但在KG-1細胞株實驗中IL-6輕度上調(diào)JAK2，明顯激活STAT3，聯(lián)合用藥后能部分逆轉(zhuǎn)對STAT3的激活作用。
　　結(jié)論：
　　1、 SNS-032對多種人AML細胞株有生長抑制作用，呈時間-劑量依賴性。
　　2、 IL-6不能逆轉(zhuǎn)SNS-032對AML細胞株HL-60的生長抑制作用，提示其可以克服耐藥。
　　3、新型CDK抑制劑SNS-032能誘導(dǎo)AML細胞凋

10、亡，濃度為200 nM是能顯著誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡。
　　4、 SNS-032顯著下調(diào)HL-60細胞miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-26b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、miR-106a、miR-17和miR-378c的表達水平，顯著上調(diào)hsa-miR-320a和miR-H7*
　　5、SNS-032能顯著抑制JAK/STAT3途徑相關(guān)蛋白和CDK下游抗凋亡蛋白M