Rap1GAP對急性髓系白血病細胞生物學(xué)特性的影響及作用機理的研究.pdf

1、目的和意義：
　　Rap1GAP屬于GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins, GAPs）家族，在Rap1這種小G蛋白GTP-GDP循環(huán)中起到重要作用。鳥苷酸交換蛋白（Guanine nucleotide exchange factors, GEPs）使Rap1由結(jié)合GDP的非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)合GTP的活性狀態(tài)，而Rap1GTP的內(nèi)在水解酶活性很低，需要GAPs加速GTP的水解，使活化的下游信號及時終

2、止。Rap1(Ras-proximate1)是Ras家族中的一員，通過MEK/ERK途徑影響細胞的增殖和分化；并調(diào)節(jié)integrins介導(dǎo)的細胞粘附和遷移，許多研究表明Rap1和腫瘤的關(guān)系密切，其上游調(diào)節(jié)分子也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來在胰腺癌、甲狀腺癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Rap1GAP在這些腫瘤中表達下調(diào)，并且和腫瘤細胞的增殖、遷移相關(guān)，Rap1GAP被認為有可能是一潛在的抑癌基因。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)Rap1GA

3、P可能在骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic syndromes, MDS）發(fā)病機制中起作用。本試驗擬通過構(gòu)建Rap1GAP慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染急性髓系白血病細胞株和動物體內(nèi)模型來研究Rap1GAP對白血病細胞生物學(xué)特性的影響，探討Rap1GAP在急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia, AML）發(fā)病機制中的作用。
　　方法：
　　第一部分：實時定量PCR檢測AML患者、非惡性腫瘤血液病患者

4、骨髓單個核細胞（Bone marrow mononuclear cells, BMNCs）以及AML細胞株（NB4、HL-60、SHI-1和U937）Rap1GAP mRNA表達水平，Western Blot檢測Rap1GAP蛋白表達水平；用含有BamHI酶切位點的上下游引物將Rap1GAP cDNA克隆至含有黃綠色熒光蛋白（Flavovirens fluorescent protein, YFP）的慢病毒表達載體pRRL-Venus，

5、磷酸鈣共沉淀法在293T細胞中進行四質(zhì)粒系統(tǒng)病毒包裝，收集病毒顆粒轉(zhuǎn)染HL-60和NB4細胞，流式分選YFP陽性細胞，有限稀釋法篩選出高表達Rap1GAP單克隆陽性細胞株（H1、H2和N1、N2）；MTT法和體外集落培養(yǎng)檢測Rap1GAP對細胞增殖能力影響；ATRA和TPA誘導(dǎo)HL-60細胞分化，ATRA誘導(dǎo)NB4細胞分化，24h、48h和72h進行NBT還原試驗和流式檢測細胞表面抗原CD11b，觀察Rap1GAP對細胞分化能力影響；A

6、s2O3誘導(dǎo)HL-60和NB4細胞凋亡24h，熒光顯微鏡觀察Rap1GAP對細胞凋亡能力影響；體外跨膜實驗和明膠酶譜檢測Rap1GAP對細胞體外侵襲力影響。
　　第二部分：對4周齡的 BALB/c裸鼠進行切脾、環(huán)磷酰胺腹腔注射及全身亞致死劑量輻照等預(yù)處理后隨機分空白對照組（n=5）和實驗組（HL-60組、空載體MOCK組、R1組、R2組，每組n=8）。空白對照組經(jīng)尾靜脈注射0.2ml IMDM，實驗組經(jīng)尾靜脈接種1.2×107含不

7、同細胞的IMDM液0.2ml，后在層流柜中無菌飼養(yǎng)觀察至接種后60天。于裸鼠瀕死前或死亡后即行解剖，留取骨髓涂片，瑞氏染色觀察有無異常的白血病細胞；各臟器常規(guī)病理切片，觀察異常白血病細胞在各臟器中的浸潤情況；RT-PCR檢測裸鼠各臟器中人白血病細胞Rap1GAP和MMP-9基因的表達。
　　結(jié)果：
　　第一部分：①在BMNCs中，AML患者Rap1GAP的mRNA表達水平低于非惡性腫瘤血液病患者（P<.05）。Rap1GAP

8、在AML細胞株（NB4、HL-60、SHI-1和U937）中轉(zhuǎn)錄和蛋白水平呈較低表達。②成功構(gòu)建慢病毒表達載體pRRL-Venus-Rap1GAP，包裝出高滴度病毒顆粒，流式檢測轉(zhuǎn)染靶細胞效率為80%-90%。RT-PCR和Western Blot鑒定轉(zhuǎn)染Rap1GAP cDNA的單克隆細胞株HL-60（H1、H2）和NB4（N1、N2）均有外源性 Rap1GAP基因的整合和表達。單克隆細胞株 H1、H2和 N1、N2的Rap1GAP

9、mRNA表達水平各增加16.2、17.3倍和17.5、19.3倍，Rap1GAP蛋白表達水平亦顯著增高，Rap1-GTP蛋白顯著降低。③細胞生長曲線和體外集落培養(yǎng)亦證實Rap1GAP不影響白血病細胞株HL-60和NB4細胞增殖能力，Western Blot未檢測到ERK和p-ERK在Rap1GAP高表達細胞和空載體對照細胞之間的差異。④ATRA誘導(dǎo)HL-60分化過程中，H1和H2單克隆細胞組CD11b表達高于空載體轉(zhuǎn)染對照組， CD11

10、b表達為對照組1.4到2.1倍，24h時CD11b表達差異最為顯著。NBT還原實驗結(jié)果和流式檢測CD11b表達相符。TPA誘導(dǎo)HL-60分化48h和72h，H1和H2組表面CD11b顯著高于對照組，而24h兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。ATRA誘導(dǎo)NB4細胞分化24h、48h，N1、N2組CD11b表達顯著增加為對照組1.2到2.0倍，而72h兩組之間區(qū)別不明顯。NBT結(jié)果和CD11b表達變化相似。⑤As2O3處理HL-60和NB4細胞24h，

11、Rap1GAP組即可觀察到明顯的凋亡細胞，而對照組細胞凋亡不明顯。⑥Rap1GAP高表達單克隆細胞株H1和H2的侵襲率顯著高于對照組HL-60細胞侵襲率（P<.001）。H1和H2分泌更多的MMP-9，而MMP-2在兩者之間差別不明顯。H1和H2的MMP-9轉(zhuǎn)錄水平增加，約為對照組細胞的12倍左右。
　　第二部分：空白對照組裸鼠注射后1－2周進食減少、體重下降、消瘦，2周后逐漸恢復(fù)正常，生存期大于60天以上無死亡。HL-60組和M

12、OCK組裸鼠尾靜脈注射細胞后，亦出現(xiàn)1－2周進食減少、體重下降、消瘦，2周后漸漸恢復(fù)，但6周左右再次出現(xiàn)進食減少，消瘦，逐漸衰竭死亡。HL-60組平均存活時間為(44.25±2.12)d， MOCK組平均存活時間為(43.62±2.32)d。R1和R2組裸鼠發(fā)病時間較HL-60組提前，注射細胞后4－5周即再次出現(xiàn)進食減少，體重下降，消瘦，衰竭死亡，3只裸鼠出現(xiàn)雙下肢癱瘓。R1組平均存活時間(32.00±1.85)d、R2組平均存活時間(

13、33.37±2.50)d。HL-60組和MOCK組裸鼠生存期無差別，R1組和R2組裸鼠較HL-60組生存期縮短（P<.05）。R1組和 R2組裸鼠共有3只裸鼠出現(xiàn)腦膜組織浸潤，腦膜組織擴增出Rap1GAP和MMP-9基因，部分裸鼠骨髓涂片中檢測到人白血病細胞，而其他臟器白血病細胞浸潤不明顯。HL-60組和MOCK組裸鼠各臟器白血病細胞浸潤不明顯，未擴增出Rap1GAP和MMP-9基因。
　　結(jié)論：
　?。?）Rap1GAP在

14、AML患者BNMCs中和急性髓系白血病細胞株（HL-60、NB4、SHI-1和U937）中均低表達。
　?。?）外源性上調(diào)Rap1GAP不影響HL-60和NB4細胞增殖能力。
　　（3）外源性上調(diào)Rap1GAP促進HL-60和NB4細胞誘導(dǎo)分化能力。
　?。?）外源性上調(diào)Rap1GAP降低HL-60和NB4細胞抗凋亡能力。
　　（5）外源性上調(diào)Rap1GAP增加HL-60體外和小鼠動物模型體內(nèi)侵襲能力。
　

15、　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)相對于非惡性腫瘤血液病患者 Rap1GAP在 AML患者BMNCs中低表達，利用慢病毒表達載體上調(diào)白血病細胞株HL-60和NB4中Rap1GAP水平（17-19倍），我們發(fā)現(xiàn)Rap1GAP不影響HL-60和NB4細胞增殖能力，而促進了ARTA誘導(dǎo)的HL-60和NB4細胞分化及TPA誘導(dǎo)的HL-60分化，而且上調(diào)Rap1GAP降低了白血病細胞株HL-60和NB4的抗As2O3誘導(dǎo)凋亡能力。而體外跨膜實驗和白血病動物模