Rap1GAP對(duì)細(xì)胞粘附連接形成過程的影響.pdf

1、目的：研究RaplGAP在粘附連接(Adherent junction AJ)形成過程中所發(fā)揮的作用。RaplGAP是小分子G蛋白R(shí)apl的GTP酶激活蛋白(GTPase activating protein)，它可以加速rap1由活化形式(與GTP結(jié)合)轉(zhuǎn)變?yōu)槿セ罨问?與GDP結(jié)合)。許多研究表明活化形式的Rapl可促進(jìn)粘附連接的形成。有研究表明Rap1GAP能抑制粘附連接的形成甚至使已形成的粘附連接破壞，但也有的研究者發(fā)現(xiàn)Rapl

2、GAP并不能夠抑制粘附連接的形成，而只是延遲了粘附連接形成的過程。因此Rap1 GAP在粘附連接形成過程中的作用及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。由于粘附連接的破壞與上皮細(xì)胞間質(zhì)化(Epithelial myofibroblast transition EMT)以及腫瘤的轉(zhuǎn)移均有密切的聯(lián)系，因此這一研究有助于增進(jìn)我們對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理的了解，并為臨床上腫瘤的防治提供新的藥物作用靶點(diǎn)。 方法：1) 脂質(zhì)體試劑法將編碼RaplGAP或GFP的質(zhì)粒

3、轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞和Hela細(xì)胞，用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)Rapl GAP的293和Hela細(xì)胞系(293-Rap1GAP，Hela-Rap1GAP)以及穩(wěn)定表達(dá)GFP的293和Hela細(xì)胞系(293-GFP，Hela-GFP)，對(duì)篩選后得到的克隆用熒光顯微鏡技術(shù)和Westernblot技術(shù)進(jìn)行鑒定。2) 繪制293-RaplGAP、Hela-RaplGAP、293-GFP、Hela-GFP、293和Hela細(xì)胞的生長曲線，觀察RaplGA

4、P對(duì)細(xì)胞增殖的影響。3) 相差顯微鏡和免疫熒光技術(shù)觀察293-Rapl GAP細(xì)胞間的粘附。4) 將Gaz和Rapl GAP共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞，觀察Rap1GAP在細(xì)胞中的定位；熒光顯微鏡技術(shù)觀察在鈣離子螫合實(shí)驗(yàn)過程中Rapl GAP在293-Rapl GAP細(xì)胞中的定位。5) 免疫熒光技術(shù)觀察鈣離子螯合實(shí)驗(yàn)過程中Rapl GAP和N-鈣粘蛋白在293 -Rapl GAP細(xì)胞中的定位。6) 免疫熒光技術(shù)觀察鈣離子螯合實(shí)驗(yàn)過程中Integ

5、rin-β-1在293-Rap1GAP細(xì)胞中的定位。 結(jié)果：1) 熒光顯微鏡觀察及westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了G418篩選后獲得了穩(wěn)聲表達(dá)Rap1GAP或GFP的293和Hela細(xì)胞系。2)生長曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯：Hela-Rap1GAP的增殖速度比Hela-GFP和Hela慢， 293-Rap1GAP的增殖速度與I 293-GFP和293a細(xì)胞無差別。3)293-Rap1GAP成片狀生長N-鈣粘蛋白集中分布于細(xì)胞間粘附部位

6、。4)Rap1GAP能在外源的活化型Gαz的作用下向細(xì)胞間的粘附部位聚集；而且在EGTA作用30min時(shí)，Rap1GAP可自發(fā)地向細(xì)胞間的粘附部位聚集。5)鈣離子螯合實(shí)驗(yàn)結(jié)合免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示： (a)293-Rapl GAP的粘附連接在EGTA作用60min后才被破壞，而293-GFP的粘附連接在EGTA作用15min后即被破壞。(b)293-Rap1GAP和293-GFP的粘附連接在恢復(fù)鈣離子濃度30min后均完全恢復(fù)，兩組間無明

7、顯差異。 (C)EGTA作用前Rap1GAP主要分布于胞漿，EGTA作用15、30、45min時(shí)Rap1GAP向細(xì)胞間粘附部位聚集，EGTA作用60min時(shí)Rap1GAP又主要分布于胞漿，恢復(fù)鈣離子濃度15min時(shí)Rap1GAP向細(xì)胞間粘附部位聚集，恢復(fù)鈣離子濃度30min時(shí)Rap1GAP又主要分布于胞漿。6)Integrin-β1定位于細(xì)胞間粘附部位， EGTA對(duì)Integrin-β-1參與構(gòu)成的連接無影響。 結(jié)論：研究結(jié)果表