C3G-Rap1信號通路中Rap1表達對Rap1酶活性及卵巢惡性浸潤能的貢獻.pdf

1、目的:探討C3G/Rap1信號通路中Rap1蛋白對Rap1酶活性及卵巢癌惡性浸潤能的貢獻，并分析其可能的機制。
　　方法:
　　1.免疫印跡檢測驗證上皮性卵巢癌組織中Dock180與C3G的表達相關(guān)性;免疫組化比較卵巢癌組織中Dock180與C3G的表達趨勢;免疫熒光觀察SKOV3中Dock180與C3G及它們各自的下游蛋白Rac1/Rap1的定位。
　　2.免疫印跡檢測并比較Rap1在上皮性卵巢癌組織、卵巢良性組織和

2、正常卵巢組織中的表達。
　　3.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建三個Rap1 shRNA真核表達載體;用LipofectamineTM2000將三個重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒、陰性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進卵巢癌細胞株SKOV3，通過免疫印跡對重組質(zhì)粒進行有效性篩選，G418篩選建立SKOV3-Rap1-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。
　　4.觀察Rap1基因沉默后卵巢癌細胞株SKOV3中Rap1酶活性的變化及其生物學(xué)行為的影響:免疫熒光觀察焦點粘連的形成，MT

3、T實驗、劃痕愈合實驗、Matrigel Transwell侵襲實驗檢測細胞的惡性表型，明膠酶譜法檢測明膠酶活性的變化，GST-pull down實驗檢測Rap1酶活性的改變。
　　結(jié)果:
　　1.Dock180與C3G在卵巢癌組織中的表達呈現(xiàn)相反趨勢;C3G/Dock180均主要分布于胞質(zhì)，下游效應(yīng)蛋白Rap1/Rac1在胞膜和胞質(zhì)都有表達，但Rap1以胞質(zhì)為主，而Rac1可以伸展至胞膜及胞膜皺褶。
　　2.與卵巢良性

4、組織和正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中Rap1呈現(xiàn)高表達(P＜0.05)。
　　3.設(shè)計三個針對人Rap1基因的三個siRNA片段，經(jīng)雙酶切和DNA測序證實成功構(gòu)建了三個重組質(zhì)粒p SUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-＃1，-Rap1i-＃2，及-Rap1i-＃3。瞬時轉(zhuǎn)染提示質(zhì)粒pSUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-＃1，-Rap1i-＃2，及-Rap1i-＃3的Rap1抑制效率分別是50％，66％

5、，19％，遂最終采用pSUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-＃2轉(zhuǎn)染并用G418篩選出單克隆細胞Rap1i-1和Rap1i-2，其Rap1蛋白抑制率分別為70％和48％，我們選取Rap1i-1細胞進一步驗證Rap1沉默后細胞表型及Rap1酶活性的變化。
　　4.與對照組相比，Rap1沉默的細胞組腫瘤細胞焦點粘連的數(shù)量以及肌動蛋白微絲骨架都無明顯變化，但表現(xiàn)出細胞增殖速度增快，細胞損傷修復(fù)能力增強，而穿過基底膜的細胞數(shù)