mTOR靶向抑制劑雷帕霉素對(duì)人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的作用及機(jī)理研究.pdf

1、急性T淋巴細(xì)胞白血病(Tcellacutelymphoblasticleukemia，T—ALL)是一種惡性程度高、預(yù)后差的淋巴系統(tǒng)惡性克隆性疾病。近年來隨著大劑量聯(lián)合化療方案的應(yīng)用，T—ALL，的預(yù)后有了較大改善，但仍有部分T—ALL患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療耐藥，出現(xiàn)難治或復(fù)發(fā)，5年無病生存率僅為28.39％。 在急性白血病中，mTOR(mammaliantargetofrapamycin，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)信號(hào)通路的異常激活不僅

2、參與白血病細(xì)胞的增殖、存活、細(xì)胞周期進(jìn)程和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，而且可能與白血病對(duì)化療藥物的耐藥性相關(guān)?，F(xiàn)已提出以TOR信號(hào)通路的關(guān)鍵分子為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略，雷帕霉素(Rapamycin)作為mTOR的靶向抑制劑對(duì)惡性血液系統(tǒng)腫瘤有著廣泛的治療前景。近年來國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對(duì)于多種實(shí)體腫瘤如前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、乳癌等，均有顯著的抗癌作用。而對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤尤其是T—ALL的作用則鮮有報(bào)道。因此本研究以人T—AL

3、L細(xì)胞株(Jurkat、Molt-4)和原代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，旨在探索mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)T—ALL細(xì)胞的作用及機(jī)理，為雷帕霉素在T—ALL中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究共分為三個(gè)部分： 第一部分雷帕霉素對(duì)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 本部分研究首先采用MTT比色法分析雷帕霉素對(duì)T—ALL細(xì)胞株Jurkat、Molt-4和原代細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示：濃度為0.1nmol/L-100nmol/L的雷帕霉素對(duì)

4、Jurkat、Molt-4細(xì)胞和原代T—ALL細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且其抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間濃度依賴效應(yīng)。雷帕霉素作用Jurkat細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞和原代T—ALL細(xì)胞72h的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitionconcentration，IC50)分別為16nmol/L、23nmol/L、16nmol/L；而作用于人正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞72h的IC50為461nmol/L，已經(jīng)遠(yuǎn)大于雷帕霉素的臨床允許血藥濃度。為探討雷帕霉素抑制T—

5、ALL細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，我們從細(xì)胞凋亡、自噬兩個(gè)方面做了進(jìn)一步的研究。 以Jurkat細(xì)胞為研究對(duì)象，采用DNA片段化分析和PARP活性檢測(cè)，并結(jié)合AnnexinV染色流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，對(duì)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。結(jié)果顯示：100nmol/L的雷帕霉素作用Jurkat細(xì)胞72小時(shí)，未出現(xiàn)DNA梯形條帶，且無PARP激活帶。1nmal/L、10nmol/L、100nmol/L的雷帕霉素作用于Jurkat細(xì)胞72小時(shí)，An

6、nexinV陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為5.33±1.33％，5.78±2.26％，5.69±2.20，與空白對(duì)照組5.37±2.19％相仿(p＞0.05)，表明雷帕霉素不能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。 除凋亡外，自噬被認(rèn)為是另一種不同于凋亡的程序性細(xì)胞死亡方式。我們采用透射電鏡觀察，可見經(jīng)100nmol/L雷帕霉素處理72h的Jurkat細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量自噬體和自噬溶酶體。結(jié)合吖啶橙染色流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Jurkat細(xì)胞經(jīng)1

7、00nmol/L雷帕霉素作用72h后，自噬細(xì)胞比例為44.56±13.79％，較空白對(duì)照組(2.55±1.50％)明顯升高(p＜0.05)。自噬抑制劑3—methyladenine(3—MA)可以顯著抑制100nmol/L雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬，而不增加凋亡細(xì)胞的比例。經(jīng)RT—PCR和Westernblot檢測(cè)不同濃度雷帕霉素處理72h后Beclin1的mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)此經(jīng)典自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著上升，呈劑量依賴性。 第二部

8、分雷帕霉素對(duì)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的mTOR信號(hào)通路、細(xì)胞周期及端粒酶活性的影響 本部分首先明確了原代T—ALL細(xì)胞和細(xì)胞株均存在mTOR信號(hào)通路的激活。10nmol/L雷帕霉素作用Jurkat細(xì)胞12h后即可見mTOR下游蛋白P70S6K和S6的磷酸化受抑制。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸化蛋白p—S6、p—P70S6K的表達(dá)逐漸減少而總S6、總P70S6K基本不變。對(duì)于mTOR的上游蛋白Akt，雷帕霉素同樣能降低其磷酸化水平。

9、 已知mTOR信號(hào)通路參與細(xì)胞周期的調(diào)控，因而我們研究了mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)T—ALL細(xì)胞周期的影響。采用PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，100nmol/L雷帕霉素作用Jurkat和Molt-4細(xì)胞，16h后可見G1期細(xì)胞比例明顯上升，而S期比例下降。采用血清饑餓法同步化處理Jurkat細(xì)胞，再通過血清釋放刺激細(xì)胞進(jìn)入S期，S期和G1期細(xì)胞比例分別為40.3％、39.1％，而經(jīng)1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L的雷帕

10、霉素處理24h后，S期比例分別為38.6％、19.9％、17.5％，G1期比例則分別為41.2％、64.3％、66.4％，說明雷帕霉素能顯著阻斷血清誘導(dǎo)的細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)化。 為進(jìn)一步探討雷帕霉素誘導(dǎo)的G1期阻滯的機(jī)制，我們用Westernblot檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4、CDK6、CyclinD2、CyclinD3、P21waf1、P27kip1、c—Myc的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)隨著雷帕霉素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Jurka

11、t細(xì)胞中P21waf1和P27kip1有上調(diào)的趨勢(shì)，而cyclinD3表達(dá)逐漸減少。雷帕霉素對(duì)CyclinD2、CDK4、CDK6均無明顯影響，但能呈濃度依賴性地抑制c—Myc蛋白表達(dá)。 另一方面，我們研究了雷帕霉素對(duì)Jurkat細(xì)胞的端粒酶活性的影響。TRAP法檢測(cè)提示雷帕霉素作用24h后，端粒酶活性開始下降，且其抑制作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。其次，用半定量RT—PCR檢測(cè)了不同濃度的雷帕霉素作用48h對(duì)hTERT的mRNA表

12、達(dá)的影響，顯示隨著藥物濃度的增加，hTERT的轉(zhuǎn)錄逐漸減少。同時(shí)，Westernblot法檢測(cè)hTERT的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能下調(diào)其蛋白含量，變化趨勢(shì)與hTERTmRNA表達(dá)相一致。 第三部分雷帕霉素聯(lián)合去甲氧柔紅霉素的抗白血病作用 蒽環(huán)類抗生素參與構(gòu)成T—ALL的聯(lián)合化療方案，本部分主要探討蒽環(huán)類代表藥物去甲氧柔紅霉素(idarubicin，IDA)聯(lián)合雷帕霉素的抗白血病效應(yīng)及機(jī)理。首先采用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IDA作

13、用Jurkat細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞48h的IC50分別為21.8nmol/L和2.21nmol/L。當(dāng)IDA聯(lián)合10nmol/L雷帕霉素作用Jurkat細(xì)胞和Molt-4時(shí)，IDA的IC50分別降為2.95nmol/L和1.28nmol/L。聯(lián)合指數(shù)小于1，說明兩藥的聯(lián)用具有協(xié)同作用。 利用電鏡形態(tài)學(xué)觀察和Annexin染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能明顯增強(qiáng)IDA的誘導(dǎo)凋亡作用。低濃度IDA單藥處理Jurkat細(xì)胞和Mol

14、t-4細(xì)胞48h，凋亡細(xì)胞比例分別為17.51±3.20％和22.78±3.54％，兩藥聯(lián)用使凋亡細(xì)胞比例分別增加為50.17±5.19％和47.33±9.03％(p＜0.05)。同樣，兩藥聯(lián)用組較IDA單用組更顯著地激活了Caspase3和底物PARP，而caspase8和caspase9在兩藥聯(lián)用組均呈現(xiàn)出最明顯的激活，說明兩藥聯(lián)用后是通過細(xì)胞膜和線粒體雙途徑影響細(xì)胞凋亡的。 為進(jìn)一步研究凋亡的線粒體途徑，我們采用Weste

15、rn分析了啟動(dòng)線粒體凋亡途徑的重要蛋白Bax、Bc1-2、Survivin，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能逆轉(zhuǎn)IDA引起的Bc1-2的上調(diào)，且兩藥聯(lián)用組的Bax/Bc1-2比值較兩藥單用組明顯顯著升高。對(duì)于Survivin，兩藥聯(lián)用較兩藥單用對(duì)Survivin下調(diào)無明顯增強(qiáng)作用。 此外，IDA能使mTOR信號(hào)通路上的Akt、P85S6K和P70S6K發(fā)生磷酸化激活，聯(lián)用雷帕霉素后能使P85S6K、P70S6K和Akt磷酸化水平明顯降低。單用ID

16、A或單用雷帕霉素對(duì)ERK的磷酸化均無明顯影響，但兩藥一旦聯(lián)用，則能協(xié)同下調(diào)ERK的磷酸化水平。說明兩藥聯(lián)用能通過抑制Akt/mTOR、ERK信號(hào)通路而發(fā)揮抗T—ALL作用。 綜上所述，本研究得出以下結(jié)論：(1)雷帕霉素可直接抑制T—ALL細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有劑量時(shí)間依賴性。(2)單用雷帕霉素并不能引起細(xì)胞凋亡，但可誘導(dǎo)自噬，并伴有自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)增加。3—MA阻斷自噬不能促使向凋亡轉(zhuǎn)化。(3)雷帕霉素對(duì)mTOR上游A

17、kt和下游P70S6K、S6的磷酸化均有抑制作用。(4)雷帕霉素可使T—ALL細(xì)胞周期受阻于G1期，并下調(diào)CyclinD3和c—Myc，上調(diào)P21waf1、P27kip1的表達(dá)。(5)雷帕霉素能夠抑制細(xì)胞端粒酶活性，并下調(diào)hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)水平。(6)雷帕霉素和IDA對(duì)T—ALL細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有協(xié)同作用。兩藥聯(lián)用時(shí)能通過線粒體和細(xì)胞膜雙途徑增強(qiáng)凋亡效應(yīng)，且通過調(diào)控Bax、Bc1-2、Survivin等影響線粒體途徑的調(diào)亡。