聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子組合對(duì)急性髓系白血病患者骨髓來(lái)源CD34+白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化為NK細(xì)胞作用的研究.pdf

1、目的：以不經(jīng)過(guò)免疫磁珠分選（Magnetic Activated Cell Sorting，MACS）和富集的初治高白細(xì)胞血癥急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）患者的骨髓血單個(gè)核細(xì)胞（CD34+細(xì)胞比例為（79.32±5.98）％）作為初始培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)用兩組不同的細(xì)胞因子組合，建立CD34+細(xì)胞向自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK細(xì)胞）轉(zhuǎn)化的體外培養(yǎng)體系，比較兩組細(xì)胞因子組合誘

2、導(dǎo)分化作用的異同。研究聯(lián)合應(yīng)用重組人白細(xì)胞介素12（recombinant human interleukin-12，rhIL-12）、重組人白細(xì)胞介素15（recombinant human interleukin-15，rhIL-15）對(duì)NK細(xì)胞的分化、增殖、細(xì)胞活性、細(xì)胞毒作用以及Granzyme B、TNF-α、IFN-γ等基因的表達(dá)的作用，探討聯(lián)合應(yīng)用IL-12、IL-15在誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞向NK細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用及優(yōu)勢(shì)。

3、r>　　方法：
　　1.提取骨髓血單個(gè)核細(xì)胞（Bone Marrow Blood-Mononuclear Cells，BM-MNC）以6位白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥100×109/L的初治急性髓系白血病患者為研究對(duì)象（患者均簽署知情同意書(shū)），取其骨髓血約5ml，肝素抗凝，應(yīng)用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液（相對(duì)密度1.077）密度梯度離心法分離得到骨髓血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞和CD3-CD56+NK細(xì)胞比例，同時(shí)檢

4、測(cè)CD69以及NKp46、NKG2D的表達(dá)情況作為對(duì)照。同時(shí)將一部分單個(gè)核細(xì)胞凍存于液氮中，作為靶細(xì)胞以及PCR對(duì)照組細(xì)胞備用。
　　2.體外建立NK細(xì)胞誘導(dǎo)體系應(yīng)用RPMI l640完全培養(yǎng)基（含1%青霉素和鏈霉素，1mM L-谷氨酰胺和10%熱滅活胎牛血清）混勻得到的單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整其細(xì)胞密度為2×105/ml，接種于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶中加入細(xì)胞懸液5ml。根據(jù)不同的細(xì)胞因子組合，實(shí)驗(yàn)共分為2組：A組（SCF、IL-7、

5、IL-12、IL-15）；B組（SCF、IL-7、IL-2、IL-15）。所加入細(xì)胞因子的濃度為：SCF、IL-7、IL-15均為20ng/ml，IL-12為2ng/ml，IL-2為1000U/ml。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、含有5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5周，每周全量換液及補(bǔ)充細(xì)胞因子。
　　3.NK細(xì)胞增殖情況檢測(cè)每周各取A、B組1ml細(xì)胞懸液，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞密度，并計(jì)算A、B組細(xì)胞總數(shù)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD

6、3-CD56+NK細(xì)胞比例，進(jìn)而計(jì)算A、B組總細(xì)胞中CD3-CD56+NK細(xì)胞比例。5周誘導(dǎo)分化結(jié)束時(shí)，同時(shí)檢測(cè)A、B組中CD34+細(xì)胞比例。
　　4.檢測(cè)各組NK細(xì)胞活化情況應(yīng)用流式細(xì)胞儀，檢測(cè)誘導(dǎo)分化5周的A、B組NK細(xì)胞活化標(biāo)志CD69分子的表達(dá)情況，以及NK細(xì)胞表面活化性受體NKp46、NKG2D的表達(dá)情況。
　　5.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time quantitative polymerase c

7、hain reaction，qPCR）（2-△△Ct相對(duì)定量法）檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況檢測(cè)誘導(dǎo)分化5周的A、B組NK細(xì)胞Granzyme B、TNF-α、IFN-γ基因的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)前凍存的患者骨髓血單個(gè)核細(xì)胞上述基因表達(dá)水平作為對(duì)照。
　　6.應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性以誘導(dǎo)分化5周的A、B組NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以K562細(xì)胞和凍存的患者骨髓血分離的單個(gè)核細(xì)胞（患者來(lái)源白血病細(xì)胞）分別作為靶細(xì)胞，應(yīng)用CCK

8、-8試劑盒檢測(cè)效靶比為1∶1、5∶1、10∶1時(shí)的殺傷率。
　　結(jié)果：
　　1.6位初治急性髓系白血病患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（122.50±15.98）×109/L，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其骨髓血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例為（79.32±5.98）%，NK細(xì)胞比例為（0.45±0.19）%，CD56+CD69+細(xì)胞比例為（0.67±0.15）%，CD56+NKp46+細(xì)胞比例為（0.34±0.21）%，CD56+NKG2D+細(xì)胞比

9、例為（0.31±0.12）%。
　　2.經(jīng)5周誘導(dǎo)分化后，A組CD3-CD56+NK細(xì)胞比例為（71.22±2.25）%， B組為（56.32±3.97）%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A組CD34+細(xì)胞的比例（0.06±0.06）%，B組為（0.08±0.07）%。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，兩組細(xì)胞因子組合均可將骨髓血CD34+細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為NK細(xì)胞，誘導(dǎo)分化5周時(shí)A、B組中幾乎不含CD34+細(xì)胞，與IL-2、IL-15

10、組相比，聯(lián)合應(yīng)用IL-12、IL-15組可以顯著提高NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。
　　3.5周誘導(dǎo)分化結(jié)束，A組細(xì)胞總數(shù)為（1.53±0.17）×108，B組細(xì)胞總數(shù)為（1.37±0.13）×108，培養(yǎng)前各組細(xì)胞總數(shù)相等，為1×106，培養(yǎng)后A組細(xì)胞擴(kuò)增了153±17倍，B組細(xì)胞擴(kuò)增了137±13倍，兩組比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明聯(lián)合應(yīng)用IL-12、IL-15組和聯(lián)合應(yīng)用IL-2、IL-15組在提高NK細(xì)胞增殖能力方面

11、無(wú)顯著差異。
　　4.NK細(xì)胞活化標(biāo)志CD69+表達(dá)比例為：A組（70.72±3.62）%；B組（59.98±2.86）%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000＜0.05）。NK細(xì)胞表面活化受體的表達(dá)比例為：NKp46+：A組（70.30±3.45）%；B組（60.38±2.84）%，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001＜0.05）。NKG2D+：A組（72.75±3.89）%；B組（62.30±4.25）%，差異比較具有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明，兩組細(xì)胞因子組合均可顯著促進(jìn)NK細(xì)胞活化，與IL-2、IL-15組相比，聯(lián)合應(yīng)用IL-12、IL-15組誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞具有更高的活性，具有更好的生物學(xué)效能。
　　5 PCR結(jié)果A、B組NK細(xì)胞Granzyme B、TNF-α和IFN-γ基因的表達(dá)水平較凍存的患者骨髓血單個(gè)核細(xì)胞顯著升高。Fold Change（F值）：Granzyme B：A組為（13.36±1.54），B

13、組為（9.82±1.21），組間差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001＜0.05）；TNF-α：A組為（9.38±0.51），B組為（7.06±0.52），組間差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002＜0.05）；IFN-γ：A組為（6.26±0.25），B組為（4.28±0.23），組間差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明，兩組細(xì)胞因子均可促進(jìn)NK細(xì)胞上述基因的表達(dá)，與IL-2、IL-15組相比，聯(lián)合應(yīng)用IL

14、-12和IL-15可以顯著提高NK細(xì)胞上述基因的表達(dá)，可提高NK細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的能力。
　　6. CCK-8殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果A、B兩組NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率在效靶比為10∶1時(shí)最高，A組為（62.20±2.36）%，B組為（56.77±3.81）%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.803，P=0.013＜0.05）。A、B兩組NK細(xì)胞對(duì)患者骨髓來(lái)源白血病細(xì)胞的殺傷率亦在效靶比為10∶1時(shí)最高，A組為（70.78±2.

15、54）%；B組為（62.95±1.94）%；組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.900，P=0.000＜0.05）。以上結(jié)果表明：兩組誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞均具有殺傷作用，與IL-2、IL-15組相比較，聯(lián)合應(yīng)用IL-12、IL-15組可以顯著提高NK細(xì)胞的殺傷活性。在相同效靶比時(shí)，A、B兩組NK細(xì)胞對(duì)患者來(lái)源白血病細(xì)胞的殺傷率顯著高于K562細(xì)胞，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明誘導(dǎo)分化的 NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺

16、傷可能具有同體特異性。
　　結(jié)論：
　　1.初治高白細(xì)胞血癥急性髓系白血病患者的骨髓血CD34+細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化為CD3-CD56+NK細(xì)胞，且具有殺傷活性。
　　2.在誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖方面，聯(lián)合應(yīng)用IL-12、1L-15組與IL-2、IL-15組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.聯(lián)合應(yīng)用IL-12、1L-15組誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞活性、對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷率以及Granzyme B、TNF-α和IFN-γ基因的