白血病細(xì)胞來源exosomes誘導(dǎo)CTL的抗白血病作用.pdf

1、白血病是血液系統(tǒng)最常見的惡性疾病，近年來白血病的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢。上世紀(jì)末期逐漸完善的誘導(dǎo)緩解化療和支持對癥治療已可以使絕大多數(shù)的患者達(dá)到完全緩解(Complete Remission，CR)；白血病的治療目前面臨的主要問題是：有一小部分患者因原發(fā)耐藥導(dǎo)致初次誘導(dǎo)緩解治療無效不能達(dá)到完全緩解；初次誘導(dǎo)緩解治療有效能達(dá)到完全緩解的病人則還面臨著殘留白血病細(xì)胞的繼發(fā)耐藥所導(dǎo)致的復(fù)發(fā)，這一問題是目前白血病臨床治療中，也是其它腫瘤臨床治療

2、中所面臨的最大難題；因此激發(fā)患者自體的免疫功能以殺滅白血病細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞的腫瘤疫苗成為腫瘤治療研究的熱點。 免疫治療在腫瘤或白血病的治療中一直處于輔助治療的地位，至今沒有特別有效的免疫治療能應(yīng)用于臨床。研究顯示腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞可溶性抗原、腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)或蛋白肽以及腫瘤細(xì)胞RNA/DNA都攜帶有腫瘤抗原和/或腫瘤相關(guān)抗原，可以作為腫瘤疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)；但其免疫原性往往比較弱，目前還難以真正應(yīng)用于臨床解決白血病或腫瘤

3、治療中所面臨的問題。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells．DC)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能激活初始型T細(xì)胞(naive Tcells)并誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的抗原呈遞細(xì)胞，目前的研究結(jié)果提示激活的T細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答在機(jī)體抗白血病效應(yīng)中起關(guān)健作用。用白血病抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為“抗白血病治療性疫苗”的效果已得到了驗證，但是目前還有很多相關(guān)的諸如樹突狀細(xì)胞的來源和功能維持等問題

4、沒有解決，如樹突狀細(xì)胞疫苗需要大量的樹突狀細(xì)胞，功能難以保持，并且難以制定GMP(Good Manufacturing Practice)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，不宜保存等客觀問題制約著樹突狀細(xì)胞疫苗的研究和應(yīng)用。 L．Zitvogel和GRaposo等研究小組的研究結(jié)果顯示腫瘤抗原沖擊后的樹突狀細(xì)胞來源exosomes(DEX)和樹突狀細(xì)胞一樣能誘導(dǎo)明顯的抗腫瘤免疫反應(yīng)，產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)和治療作用，提示exosomes可能是更有潛能的腫瘤

5、治療型性疫苗。exosomes是一種直徑在30-100nm范圍有雙層膜的囊泡小體，可由多種細(xì)胞分泌，并且攜帶有所有抗原呈遞所需的物質(zhì)分子，包括MFtC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子CD86、CD80、以及黏附分子CD54、CD11c和CD1a-d；腫瘤細(xì)胞來源的exosomes(TEX)除攜帶有MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子、共刺激分子和粘附分子等抗原呈遞所需要的分子外，還攜帶有和細(xì)胞靶向相關(guān)的CD9分子以及腫瘤抗原運載系統(tǒng)熱休克蛋白分子

6、(蛋白分子伴娘，hot shock protein，HSPs)，同時也攜帶有許多腫瘤細(xì)胞所共有的共同抗原和腫瘤相關(guān)抗原，能把腫瘤抗原轉(zhuǎn)運給專職的抗原遞呈細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，從而激活體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)并放大這種免疫反應(yīng)，產(chǎn)生對腫瘤的排斥效應(yīng)。另外和DC疫苗相比exosomes還具有耐高溫、可長期冷藏、定量分析和易于制定GMP生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)等優(yōu)點，因而被認(rèn)為是新的抗原傳送和呈遞的載體，同時也是更有潛能的腫瘤治療性疫苗。 基于此本課題研究了白

7、血病細(xì)胞來源exosomes誘導(dǎo)的CTL的抗白血病作用。 實驗方法 第一部分 K562細(xì)胞來源exosomes體外誘導(dǎo)的CTL對K562細(xì)胞的殺傷作用 1．K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化樹突狀細(xì)胞(KS62-DCs)的誘導(dǎo)和鑒定根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法，用含有重組人粒細(xì)胞．單核細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)及腫瘤壞死因子α(rhTNF-α)的RPMI-1640細(xì)胞營養(yǎng)液培養(yǎng)K562細(xì)胞誘導(dǎo)樹

8、突狀細(xì)胞生成。在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)前后細(xì)胞表面CD34、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86和CD54等樹突狀細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)：電鏡下觀察并攝像其典型形態(tài)。 2．K562細(xì)胞和K562-DCs分泌exosomes的提取和鑒定收集對數(shù)生長期的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液和培養(yǎng)第12-14天的K562-DCs的培養(yǎng)上清液，根據(jù)文獻(xiàn)報道的多步驟離心獲取exosomes的方法，

9、通過低速離心、高速離心去除細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，再把上清液經(jīng)過100,000g超高速離心1小時，獲取的沉淀即為exosomes。紫外分光光度儀對exosomes進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)12％SDS-PAGE電泳觀察蛋白帶型，western blot檢測所攜帶的標(biāo)志性分子；電子顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。 3．K562細(xì)胞來源exosomes誘導(dǎo)CTL對K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞的殺傷作用用K562細(xì)胞來源exosomes(

10、Kexo)刺激正常人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的樹突狀細(xì)胞(MC-DCs)作為實驗組，未刺激組做為對照組，然后分別誘導(dǎo)正常人T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生CTL，MTT法檢測兩組CTL對K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞的殺傷作用。 4．不同K562細(xì)胞exosomes誘導(dǎo)CTL對K562細(xì)胞的殺傷作用分別用K562細(xì)胞源exosomes(Kexo)、K562-DCs源exosomes(DCexo)、熱休克K562細(xì)胞源exosomes(Hexo)、K5

11、62細(xì)胞凍融抗原和K562細(xì)胞總RNA抗原沖擊K562-DCs源exosomes(Rexo、Fexo)刺激正常人MC-DCs，并進(jìn)一步誘導(dǎo)活化CTL效應(yīng)細(xì)胞，MTT法檢測CTL效應(yīng)細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷作用。 5．不同K562細(xì)胞exosomes聯(lián)合CPG佐劑誘導(dǎo)CTL對K562細(xì)胞的殺傷作用同上方法檢測K562細(xì)胞來源exosomes(Kexo)、K562-DC分泌exosomes(DCexo)和RNA抗原沖擊K562-DC

12、 exosomes(Rexo)單獨或聯(lián)合CpG ODN佐劑后誘導(dǎo)CTL對K562細(xì)胞的殺傷活性。 第二部分 CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染對K562細(xì)胞、K562-DCs及分泌exosomes的影響 1．CKLF、CKLFSF8在K562細(xì)胞和K562-DCs中的表達(dá)，首先采用免疫組化方法用CKLF單抗檢測CKLF在K562細(xì)胞和K562-DC中的表達(dá)，再分別提取K562細(xì)胞和K562細(xì)胞總RNA抗原荷載K562-DCs后的RN

13、A，根據(jù)CKLFSF8基因特異性引物，采用RT-PCR方法觀察CKLFSF8在K562細(xì)胞和K562-DCs中的表達(dá)。 2．CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染對K562細(xì)胞和K562-DCs及其分泌exosomes的影響用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑把攜帶CKLFSF8基因片段的pcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞和K562-DCs中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長，MTT法檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞表面EGFR(EGF受體)的表達(dá)，并提取相應(yīng)細(xì)胞

14、培養(yǎng)上清液中的exosomes，經(jīng)12％SDS-PAGE電泳觀察蛋白帶型，western blot鑒定所攜帶exosomes的標(biāo)志性分子，電子顯微鏡下觀察其形態(tài)特征及其分泌的變化。 第三部分 CML患者原代白血病細(xì)胞源exosomes誘導(dǎo)的CTL對自體白血病細(xì)胞的殺傷作用 1．CMI．患者原代白血病細(xì)胞來源exosomes誘導(dǎo)CTL對患者白血病細(xì)胞的殺傷作用CML患者抗凝外周血梯度離心獲取原代白血病細(xì)胞并培養(yǎng)，同第一部分

15、方法獲取CML患者原代白血病細(xì)胞來源exosomes(Pexo)，MTT法檢測K562細(xì)胞來源exosomes(Kexo)和Pexo誘導(dǎo)的患者CTL對患者原代白血病細(xì)胞的殺傷作用。 2．不同方法獲取的Pexo誘導(dǎo)的CTL對患者白血病細(xì)胞的殺傷作用同第一部分方法MTT法檢測CML患者Pexo、CML，患者原代白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化樹突狀細(xì)胞來源exosomes(PDCexo)和患者白血病細(xì)胞凍融抗原刺激白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化樹突狀細(xì)胞來源

16、exosomes(PFexo)單獨或聯(lián)合CPG ODN佐劑誘導(dǎo)的CTL對患者白血病細(xì)胞的殺傷作用。 3．PFexo誘導(dǎo)同種異體CTL對患者白血病細(xì)胞的殺傷作用取患者治療后正常自體和HLA完全相合同胞外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天分別加入終濃度為20ug/ml的PFexo繼續(xù)培養(yǎng)48小時，再分別加入同源T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)CTL生成，MTT法檢測對患者白血病細(xì)胞的殺傷作用。 結(jié)論： 1．K562白血病

17、細(xì)胞和慢性粒細(xì)胞白血病患者原代白血病細(xì)胞均可以誘導(dǎo)分化成樹突狀細(xì)胞，并且白血病細(xì)胞和白血病樹突狀細(xì)胞均分泌exosomes。 2．白血病細(xì)胞和白血病樹突狀細(xì)胞分泌的exosomes攜帶有抗原呈遞所需要的物質(zhì)分子，并且有抗原呈遞功能，可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化產(chǎn)生對白血病細(xì)胞的特異性和交叉殺傷作用。CpG ODN免疫佐劑可以增強(qiáng)exosomes誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。 3．CKLFSF8在K562細(xì)胞和K562-DCs都有表達(dá)，K