Nischarin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布及功能研究.pdf

1、背景:
　　目前針對(duì)脊髓損傷的臨床治療仍然缺乏有效手段，如何促進(jìn)損傷后神經(jīng)再生，提高臨床治療效果，是神經(jīng)科學(xué)研究者的研究重點(diǎn)。軸突內(nèi)細(xì)胞骨架是脊髓損傷后微環(huán)境中多種細(xì)胞外部信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的整合位點(diǎn)，越來(lái)越多的研究均證明通過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架蛋白的重組可綜合細(xì)胞外部因素和內(nèi)在因子的作用，顯著改善軸突再生的能力并促進(jìn)功能的恢復(fù)。細(xì)胞骨架蛋白則受細(xì)胞內(nèi)多種蛋白調(diào)控因子調(diào)控，因而這些能作用于軸突內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)控因子對(duì)脊髓損傷的修復(fù)有著舉足輕重

2、的作用。
　　Nischarin是2000年發(fā)現(xiàn)的一種分布于多種細(xì)胞胞漿的蛋白質(zhì)。在過(guò)去的十年中關(guān)于Nischarin蛋白的功能研究主要集中于它對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的抑制作用上。Alahari及同事發(fā)現(xiàn)Nischarin在胞漿內(nèi)可與Rho GTPase家族的重要成員Rac1、PAK結(jié)合并直接抑制它們的活性，從而減弱細(xì)胞的活動(dòng)能力。隨著研究的深入，又發(fā)現(xiàn)Nischarin不僅能抑制PAK，還能直接抑制PAK下游的關(guān)鍵激酶LIMK的活性

3、，從而阻礙細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白cofilin的磷酸化，進(jìn)而影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。這些研究表明，腫瘤細(xì)胞的內(nèi)源性Nischarin可通過(guò)調(diào)控RhoGTPase/PAK/LIMK/cofilin信號(hào)通路，影響細(xì)胞骨架蛋白的重組。如前所述，能調(diào)控神經(jīng)元軸突內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白重組的因子對(duì)脊髓損傷修復(fù)有極其重要的意義，Nischarin若在神經(jīng)元中表達(dá)，且也能通過(guò)Rho GTPase信號(hào)通路調(diào)控軸突內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白重組，則應(yīng)該有理由成為脊髓損傷治療中的一個(gè)新靶

4、標(biāo)。
　　為此，本課題的主要研究目的為:探討新蛋白Nischarin在正常成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)與分布;研究Nischarin蛋白在脊髓損傷后軸突再生過(guò)程中的作用及其可能機(jī)制。獲得以上兩塊內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并加以分析，可望拓展對(duì)新蛋白Nischarin功能的研究范圍，并可能為脊髓損傷的基因或分子治療提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1取正常成年大鼠組織，用RT-qPCR、western blot及免疫熒光染色方法檢

5、測(cè)大鼠各主要器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位Nischarin的表達(dá)情況。
　　2建立大鼠脊髓損傷模型，探討損傷后不同階段Nischarin蛋白在脊髓組織的表達(dá)情況;在細(xì)胞水平通過(guò)RNAi技術(shù)抑制內(nèi)源性Nischarin蛋白表達(dá)，采用活細(xì)胞成像技術(shù)觀察神經(jīng)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的變化。
　　3采用免疫共沉淀技術(shù)研究神經(jīng)元內(nèi)源性Nischarin與PAK1、LIMK1的互作情況;探討Nischarin對(duì)PAK1、LIMK1及cofilin的磷酸

6、化調(diào)控作用及其對(duì)細(xì)胞骨架蛋白F-actin的調(diào)控;活細(xì)胞成像法觀察PAK1的特異性抑制劑IPA3對(duì)Nischarin-shRNA調(diào)控神經(jīng)突起生長(zhǎng)作用的影響。
　　結(jié)果:
　　1 Nischarin蛋白在正常成年大鼠的心、肺、肝、腎、胃、小腸、腦和脊髓組織中均有表達(dá)，在肝臟和腦組織中最為豐富;其mRNA及蛋白廣泛表達(dá)于腦的各個(gè)部位，在大腦皮層神經(jīng)元上表達(dá)量最高，海馬區(qū)神經(jīng)元其次，腦干和嗅球部位則較低，且只表達(dá)于神經(jīng)元而非膠質(zhì)細(xì)

7、胞;在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，Nischarin的表達(dá)集中在細(xì)胞的核周及細(xì)胞突起的前緣。
　　2在正常成年大鼠脊髓組織上，Nischarin主要分布在前角運(yùn)動(dòng)核神經(jīng)元的核周胞漿中;與正常大鼠脊髓組織比較，Nischarin mRNA的表達(dá)從SCI后1d起顯著增高，損傷后7d達(dá)到頂峰（P＜0.01），隨后下降;與之相符，SCI后1d起Nischarin蛋白的表達(dá)即有顯著增高（P＜0.05），損傷后7d達(dá)到最高（P＜0.05），此后下降;免疫熒光

8、染色結(jié)果提示SCI后3d，脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂，除神經(jīng)元有Nischarin表達(dá)外，膠質(zhì)細(xì)胞上也一定量的表達(dá);損傷后7d，損傷區(qū)Nischarin高度表達(dá)，大量膠質(zhì)細(xì)胞增生;用aggrecan、CSPGs或TNF-α三種脊髓損傷局部產(chǎn)物處理Neuro-2a細(xì)胞，孵育2h后對(duì)Nischarin的表達(dá)影響不大（P＞0.05），孵育24 h和48 h后三者均顯著促進(jìn)Nischarin的表達(dá)（P＜0.05）。
　　3①用Nis-siRNA轉(zhuǎn)染

9、Neuro-2a細(xì)胞能有效抑制內(nèi)源性Nischarin的表達(dá)，抑制率達(dá)到86％（P＜0.01），Neuro-2a細(xì)胞的神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生明顯變化，有突起細(xì)胞百分比較control-siRNA組細(xì)胞增加3.3倍（P＜0.001），最長(zhǎng)突起平均值增長(zhǎng)5.4倍（P＜0.001），而平均細(xì)胞突起數(shù)目增加了1.57倍（P＜0.01）;②將4條Nis-shRNA克隆到慢病毒質(zhì)粒載體，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞評(píng)價(jià)其對(duì)Nischarin的內(nèi)源性表

10、達(dá)的抑制效果，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示Neuro-2a細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80％以上，與未處理細(xì)胞和對(duì)照shRNA比較，4個(gè)Nis-shRNA質(zhì)粒均能有效抑制Nischarin的表達(dá)，其中Nis-shRNA-3的抑制效率到達(dá)60％(P＜0.05)，Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，4個(gè)Nis-shRNA質(zhì)粒中以3號(hào)質(zhì)粒的抑制效果為最佳，抑制率為81.3％（P＜0.01）;③用慢病毒包裝體系對(duì)3號(hào)質(zhì)粒及其

11、scramble對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)行包裝，收獲病毒液，感染PC-12細(xì)胞和原代培養(yǎng)神經(jīng)元，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源性Nischarin表達(dá)顯著促進(jìn)PC-12細(xì)胞神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，細(xì)胞最長(zhǎng)神經(jīng)突起的平均值增加140％（P＜0.01），每個(gè)細(xì)胞的平均突起數(shù)目增加56％（P＜0.05），神經(jīng)突起生長(zhǎng)速度明顯增快;抑制內(nèi)源性Nischarin表達(dá)也促進(jìn)原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，細(xì)胞最長(zhǎng)神經(jīng)突起的平均值增加51％（P＜0.05），但對(duì)神經(jīng)元的平均突

12、起數(shù)目影響不顯著（P＞0.05）;④膠質(zhì)瘢痕抑制物aggrecan或CSPGs使Neuro-2a細(xì)胞的最長(zhǎng)神經(jīng)突起平均值和突起數(shù)目均顯著下降，而當(dāng)內(nèi)源性Nischarin被抑制后，不僅使得PDL基質(zhì)上的神經(jīng)細(xì)胞的突起生長(zhǎng)加速，而且還促使細(xì)胞克服CSPGs或aggrecan對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)的抑制作用(P＜0.05)。
　　4①免疫共沉淀結(jié)果顯示，神經(jīng)元內(nèi)源性Nischarin可以與PAK1、LIMK1結(jié)合;②用Nischarin-shRN

13、A轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞使其內(nèi)源性Nischarin表達(dá)量降低75％（P＜0.01），于此同時(shí)，p-PAK1/PAK1比值、p-LIMK1/LIMK1比值及p-cofilin/cofilin比值分別增加了41.5％（P＜0.05）、40％（P＜0.05）及57.5％(P＜0.01);而在SCI大鼠模型上， Nischarin的表達(dá)先增高再下降，在損傷后一周達(dá)到峰值，比sham組增高196％（P＜0.01），而p-PAK1/PAK1、p

14、-LIMK1/LIMK1及p-cofilin/cofilin比值均呈現(xiàn)先降低再增高的趨勢(shì)，并且均在損傷后一周達(dá)到最低值，分別比sham組下降了40.2％（P＜0.05）、56.3％（P＜0.01）及61.8％(P＜0.01);③免疫熒光染色結(jié)果顯示，在感染Nischarin-shRNA病毒的EGFP陽(yáng)性神經(jīng)元上，神經(jīng)突起生長(zhǎng)錐處F-actin的含量顯著增高;④抑制內(nèi)源性Nischarin的表達(dá)可促使抑制性環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞的突起生長(zhǎng)，但這種

15、促進(jìn)作用在加入PAK1的抑制劑IPA3之后被完全逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1 Nischarin在正常成年大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈區(qū)域化分布，主要表達(dá)于神經(jīng)元胞漿核周部位及神經(jīng)突起前緣。
　　2脊髓損傷可引起Nischarin的表達(dá)時(shí)間依賴(lài)性增高，其表達(dá)上調(diào)可能與脊髓損傷局部高濃度的TNF-α、抑制性物質(zhì)CSPGs和aggrecan有關(guān)。
　　3用RNAi技術(shù)抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性Nischarin的表達(dá)后