消退素D1對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應以及小膠質(zhì)細胞極化的影響.pdf

1、本文分三個部分進行探討:
　　第一部分：消退素D1對脂多糖誘導的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應的影響
　　目的:研究消退素D1（resolvin D1，RvD1）對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)引起的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥介質(zhì)的表達，小膠質(zhì)細胞激活，以及核因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）通路活化的影響，以探討RvD1對脂多糖誘導的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的影響及可能的機制。

2、>　　方法:健康雄性C57BL/6小鼠100只，8-12周，隨機分為五組：（1）對照組：腹腔和側(cè)腦室注射等體積生理鹽水；（2）LPS組：側(cè)腦室給予2μl生理鹽水后；立即腹腔注射LPS250μg/kg（100μl）；（3）RvD1小劑量組：側(cè)腦室給予RvD11ng（2μl）后立即腹腔注射LPS；（4）RvD1大劑量組：側(cè)腦室給予RvD110ng（2μl）后立即腹腔注射LPS；（5）拮抗劑組：側(cè)腦室給予甲酰肽受體（formyl-peptid

3、e receptor，F(xiàn)PR）拮抗劑Boc-21μg+RvD110ng（2μl）后立即腹腔注射LPS。4小時后，過量麻醉處死小鼠，免疫組化染色觀察小膠質(zhì)細胞標志物離子鈣接頭蛋白分子-1（ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1）陽性細胞；ELISA法檢測小鼠血清、皮質(zhì)以及海馬中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）和白介素-1β（int

4、erleukin-1 beta,IL-1β）濃度；Western blot檢測皮質(zhì)以及海馬組織IκB-α和胞核內(nèi)NF-κB p65亞基的表達；電泳遷移率改變分析（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）檢測皮質(zhì)和海馬組織中NF-κB DNA結(jié)合活性。
　　結(jié)果：與對照組相比，LPS組血清、皮質(zhì)以及海馬炎癥因子TNF-α和IL-1β濃度明顯增高，小膠質(zhì)細胞激活。側(cè)腦室注射RvD1對血清T

5、NF-α和IL-1β濃度無顯著影響，但RvD110ng可以抑制LPS引起的皮質(zhì)和海馬TNF-α和IL-1β濃度升高和小膠質(zhì)細胞激活，RvD11ng無顯著效果。LPS還可引起皮質(zhì)和海馬IκBα蛋白降解，胞核NF-κB p65表達增加以及NF-κB DNA結(jié)合活性的增加；RvD110ng側(cè)腦室給予可以抑制LPS引起的IκBα和NF-κB活化。FPR2拮抗劑Boc-2可以阻斷RvD1的作用。
　　結(jié)論：RvD1可降低LPS引起的神經(jīng)系統(tǒng)

6、炎性因子TNFα和IL-1β的產(chǎn)生，其抗炎作用是通過與FPR2結(jié)合進而抑制NF-κB信號通路實現(xiàn)的。
　　第二部分：消退素D1對脂多糖誘導的小膠質(zhì)細胞M1極化的影響
　　目的:小膠質(zhì)細胞存在兩種極化的激活方式：M1極化（經(jīng)典活化）和M2極化（選擇性活化）。M1極化的小膠質(zhì)細胞表達促炎癥因子，如TNF-α、IL-1β和一氧化氮（nitric oxide,NO）。該部分研究RvD1對LPS誘導的小膠質(zhì)細胞M1極化及其相關(guān)信號通路

7、的影響，以探討RvD1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮抗炎作用的機制。
　　方法:體外培養(yǎng)的小鼠 BV-2小膠質(zhì)細胞株,分為五組：（1）對照組；（2）RvD1組：用不同濃度的RvD1（0.1nM、1nM、10nM、100nM）處理；（3）LPS組：用100ng/ml LPS處理；（4）RvD1+LPS組：不同濃度的RvD1（0.1nM、1nM、10nM、100nM）處理后30min后加入LPS處理；（5）拮抗劑組:在用RvD1和LPS處理前用10μ

8、M/L Boc-2處理30min。采用MTT法檢測細胞活力，ELISA檢測培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β濃度；硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)上清中NO濃度；Western blot檢測小膠質(zhì)細胞誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表達，胞核NF-κB p65亞基表達，IκB-α蛋白的降解，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，E

9、RK）、p38以及c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）磷酸化水平；免疫熒光觀察 p65細胞內(nèi)定位；EMSA檢測 NF-κB以及激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的DNA結(jié)合活性。
　　結(jié)果：使用濃度的LPS和RvD1對BV-2細胞活力無顯著影響。LPS可引起培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、NO濃度增高，iNOS表達增加，RvD11nM、10nM、100nM

10、可降低TNF-α和IL-1β濃度。100nM RvD1可減少LPS誘導產(chǎn)生的NO和iNOS。100nM RvD1還可以抑制LPS刺激引起的IκB-α降解，p65核轉(zhuǎn)位，抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）ERK1/2、p38、JNK蛋白的磷酸化，并抑制LPS引起的NF-κB以及AP-1 DNA結(jié)合活性的增加。Boc-2可阻斷RvD1的作用。
　　結(jié)論：RvD1可抑

11、制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞M1極化而發(fā)揮抗炎作用，該作用可能與抑制NF-κB和MAPK/AP-1通路激活有關(guān)。
　　第三部分：消退素D1對白介素-4誘導的小膠質(zhì)細胞M2極化的影響
　　目的:小膠質(zhì)細胞存在兩種極化的激活方式：M1極化（經(jīng)典活化）和M2極化（選擇性活化）。M2小膠質(zhì)細胞主要介導炎癥消退以及組織修復。本部分主要研究RvD1對白介素-4（interleukin-4,IL-4）誘導的小膠質(zhì)細胞M2極化及其相關(guān)信號通路的

12、影響，以探討RvD1在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮抗炎促消退作用的機制。
　　方法:體外培養(yǎng)的小鼠BV-2小膠質(zhì)細胞株,分為五組：（1）對照組；（2）RvD1組：用100nM RvD1處理；（3）IL-4組：用10ng/ml IL-4處理；（4）RvD1+IL-4組：100nM RvD1處理30min后加入終濃度為10ng/ml的IL-4；（5）拮抗劑組:在用RvD1和IL-4處理前用10μM Boc-2或100μM來氟米特或1μM GW966

13、2處理30min。采用Western blot和免疫熒光檢測小膠質(zhì)細胞M2標志物精氨酸酶-1（Arginase1，Arg1）和幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-3（Chitinase3-like3，Ym1）蛋白表達；免疫熒光觀察胞核過氧化物酶增殖活化受體-gamma（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）細胞內(nèi)定位；Western blot檢測信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子-6（sign

14、al transducer and activator of transcription-6，STAT6）磷酸化水平以及PPARγ表達水平，EMSA檢測STAT6和PPARγ的DNA結(jié)合活性。為進一步確定FPR2、STAT6和PPARγ在RvD1和IL-4誘導的小膠質(zhì)細胞選擇性活化中的作用，我們使用 Boc-2或來氟米特或GW9662阻斷相應的受體或者通路，觀察BV-2細胞Arg1和Ym1表達。
　　結(jié)果：IL-4刺激引起小膠質(zhì)細

15、胞M2標志物Arg1和Ym1表達增多，STAT6磷酸化，胞核PPARγ表達增加以及STAT6和PPARγ DNA結(jié)合活性增加。RvD1預處理可進一步增加Arg1和Ym1表達，提高STAT6磷酸化水平、細胞核內(nèi)PPARγ表達水平以及STAT6和PPARγ的DNA結(jié)合活性。Boc-2可拮抗RvD1的作用。阻斷STAT6可抑制RvD1和IL-4引起的胞核PPARγ表達和DNA結(jié)合活力增加。阻斷STAT6或PPARγ可消除RvD1和IL-4誘導