T3SS效應(yīng)蛋白YopJ與YopT參與鼠疫耶爾森菌致病性的分子機(jī)制研究.pdf

1、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)是歷史上導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的傳染病菌，它不能直接感染人類，而是通過跳蚤等動(dòng)物產(chǎn)生間接感染。通常情況下，進(jìn)入人體的病原菌的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecule patterns，PAMPs)會(huì)被宿主的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）所識(shí)別而被免疫細(xì)胞吞噬或抑制，不能建立持續(xù)的感染。而鼠疫耶爾森菌存在某些免疫

2、逃逸機(jī)制可以逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，例如，鼠疫耶爾森菌可以通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢSecretion System，T3SS)將毒性質(zhì)粒(virulence plasmid, pYV)編碼的效應(yīng)蛋白（Yersinia outer proteins，Yops）注入宿主的巨噬細(xì)胞，繼而下調(diào)巨噬細(xì)胞的固有免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并抑制相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最后導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡，釋放出病原菌。釋放后的鼠疫菌進(jìn)一步通過淋巴進(jìn)入血液和全身器官，形成高致死性的敗

3、血癥鼠疫和肺鼠疫。
　　Yops家族成員包括YopE、YopM、YopH、YpkA（在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中為YpkO）、YopJ（在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中為YopP）、YopT等。其中，YopJ在鼠疫耶爾森菌感染宿主過程中尤為關(guān)鍵，因?yàn)樗徽J(rèn)為是唯一一個(gè)可以抑制宿主固有免疫的效應(yīng)蛋白，可以通過去泛素化TRAF2、TRAF6和IKK下調(diào)NF-κB信號(hào)通路，對(duì)鼠疫耶爾森菌在宿主細(xì)胞內(nèi)建立持續(xù)感染具有十分重要的意義。我們的研究表明，Yop

4、J也可以通過去泛素化STING抑制宿主Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的激活。除此之外，我們的初步研究表明，YopT很可能也通過其特有的去泛素化酶活性抑制RLRs信號(hào)通路的激活:
　　1、YopJ通過去泛素化STING抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的激活:
　　通過GST-pull down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)YopJ能夠與STING發(fā)生相互作用;通過熒光素酶報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)YopJ以劑量依賴的方式抑制干擾素報(bào)告基因的激活。
　　2、YopJ抑制Ⅰ型

5、干擾素信號(hào)通路的分子機(jī)制研究:
　　通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YopJ可以降低STING的穩(wěn)定性;通過體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YopJ降低STING的K63位泛素化水平;通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)STING的K370位是其重要的活性位點(diǎn);通過點(diǎn)突變的方法將YopJ半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)172位半胱氨酸突變?yōu)楸彼?，發(fā)現(xiàn)突變體喪失了對(duì)STING K63位的去泛素化修飾作用;通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該突變體無法誘導(dǎo)STING的穩(wěn)定性下調(diào);通

6、過熒光素酶報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)YopJ突變體無法抑制干擾素報(bào)道基因的激活;通過鼠疫耶爾森菌野生菌以及YopJ敲除菌感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YopJ敲除菌喪失了對(duì)STING和TBK1相互作用的抑制。
　　3、YopT可能通過其去泛素化酶活性抑制RLRs信號(hào)通路的激活:
　　通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YopT可以降低RIGI、MAVS和TBK1蛋白的穩(wěn)定性;通過體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YopT可以降低RLRs信號(hào)通路中RIG-Ⅰ的泛素化水平;通過比

7、對(duì)YopT的保守氨基酸基序，發(fā)現(xiàn)YopT很有可能是一個(gè)去泛素化酶，通過點(diǎn)突變的方法將YopT半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)139位半胱氨酸突變?yōu)榫彼?，利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該突變體不能降低RIG-Ⅰ的穩(wěn)定性;通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)YopT突變體不能抑制RLRs信號(hào)通路的激活。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)YopJ可以與STING發(fā)生相互作用，并通過其去泛素化酶活性移除STING K63位泛素化修飾，進(jìn)而降低其穩(wěn)定性，最終抑制Ⅰ型干擾素