雞白痢沙門菌T3SS2及其效應(yīng)蛋白CigR的致病與免疫作用.pdf

1、雞白痢沙門菌(Salmonella enterica serovar Pullorum，Salmonella Pullorum)，又稱雛沙門菌，是雞白痢(Pullorum disease)的病原，具有高度適應(yīng)專一宿主的特點(diǎn)，能垂直傳播，可引起雛雞的急性敗血癥，多侵害3周齡以內(nèi)幼雛，發(fā)病率和死亡率極高;對(duì)日齡較大的青年雞也可致病和致死;成年雞亦可被感染，常導(dǎo)致母雞產(chǎn)蛋減少，生殖道畸形，體重下降，也導(dǎo)致孵化率和出雛率明顯下降，還可感染火雞，

2、偶能感染其它禽和鳥類，給許多國(guó)家的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的危害，并引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，免疫接種可作為防控沙門菌病的一種重要手段，相對(duì)于傳統(tǒng)的滅活疫苗，減毒活疫苗能提供更加高效的保護(hù)，且能誘導(dǎo)較高的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　沙門菌致病島(Samonella pathogenicity island，SPI)2是位于沙門菌基因組上的一個(gè)約40 kb的主要毒力基因簇，其編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)2(typeⅢ secretion system2，T3

3、SS2)可以分泌多種功能不同的效應(yīng)蛋白，這些效應(yīng)蛋白對(duì)沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖起著重要作用，為進(jìn)一步引起全身性的感染提供必要條件。目前，已有30多個(gè)沙門菌T3SS2效應(yīng)蛋白被鑒定，其中很多效應(yīng)蛋白的功能并不單一，大部分與沙門菌的毒力密切相關(guān)，cigR是唯一一個(gè)缺失后可引起鼠傷寒沙門菌毒力上升的效應(yīng)蛋白基因。另外，并非這些效應(yīng)蛋白均存在于所有血清型的沙門菌中，這意味著有些效應(yīng)蛋白基因在部分沙門菌中是缺失的，或者有些基因在一些沙門菌中

4、是以假基因的形式存在。目前，關(guān)于沙門菌毒力基因的研究已越來越深入，但主要模型還是集中在鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌。雞白痢沙門菌具有其獨(dú)特的特征，但對(duì)于雞白痢沙門菌相關(guān)的研究還很少，尤其是在T3SS2及其效應(yīng)蛋白方面。
　　本研究主要基于T3SS2及其效應(yīng)蛋白CigR探討了其與雞白痢沙門菌致病性之間的關(guān)系，并初步評(píng)估了雞白痢沙門菌減毒株作為疫苗株防控該病的可行性，為從分子水平上探明雞白痢沙門菌與雞體的相互作用關(guān)系打下基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研

5、究雞白痢沙門菌感染與致病機(jī)理及找到更好防控該病的方法提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　1.雞白痢沙門菌致病島2缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
　　以雞白痢沙門菌菌株S06004為研究對(duì)象，采用λ-red同源重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌S06004株的致病島2（SPI2，約40kb）缺失株S06004△SPI2。然后測(cè)定了該缺失株的生長(zhǎng)特性、生化特性、遺傳穩(wěn)定性和致病性等基本生物學(xué)特性，并與野生株進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，SPI2的缺失不

6、影響雞白痢沙門菌的生長(zhǎng)特性;與野生株一樣，該缺失株均能發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、甘露醇、鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，而不能發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、側(cè)金花醇、乳糖、丙二酸鹽、尿素、L-阿拉伯糖和硫化氫等;且該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性;其對(duì)2日齡雛雞的LD50是野生株的252倍。表明SPI2在雞白痢沙門菌的致病過程中起著重要作用，SPI2的缺失引起雞白痢沙門菌毒力的顯著下降，這為進(jìn)一步研究雞白痢沙門菌SPI2的功能及研發(fā)減毒疫苗奠定了

7、基礎(chǔ)。
　　2.雞白痢沙門菌致病島2缺失株對(duì)雛雞的免疫保護(hù)效力評(píng)估
　　分別通過口服和肌肉注射兩種免疫途徑評(píng)價(jià)雞白痢沙門菌致病島2缺失株S06004△SPI2對(duì)2日齡雛雞的免疫保護(hù)效力，其中，口服免疫劑量為2×108CFU/只，肌注免疫劑量為2×107CFU/只。體重變化及臨床表現(xiàn)結(jié)果顯示，兩種免疫途徑均不影響雛雞的生長(zhǎng)性能，與對(duì)照組一樣，免疫后雛雞并未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，且該缺失株在雛雞體內(nèi)具有一定的定植能力;血清抗體水平

8、測(cè)定及外周血淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種免疫途徑均能誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng);在免疫后第10天，分別用雞白痢沙門菌菌株S06004和雞傷寒沙門菌菌株SG9對(duì)雛雞進(jìn)行攻毒，并觀察其臨床癥狀，統(tǒng)計(jì)其死亡情況，結(jié)果顯示，在攻毒早期免疫組雞出現(xiàn)了暫時(shí)的和輕微的厭食、腹瀉及精神萎頓等癥狀，5天左右即可恢復(fù)，死亡率和發(fā)病率極低，而未免疫攻毒對(duì)照組的雞卻呈現(xiàn)高發(fā)病率和死亡率，臨床癥狀明顯。上述結(jié)果表明雞白痢沙門菌減毒株S06

9、004△SPI2對(duì)雛雞具有良好的保護(hù)效力，可以作為理想的疫苗候選株，同時(shí)為雞白痢沙門菌減毒疫苗的進(jìn)一步研究提供了數(shù)據(jù)。
　　3.雞白痢沙門菌致病島2對(duì)T3SS2效應(yīng)蛋白基因表達(dá)的影響
　　經(jīng)序列分析，在雞白痢沙門菌菌株S06004染色體上共有20個(gè)T3SS2效應(yīng)蛋白基因，其中sifB、sspH2和steC是以假基因的形式存在。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，通過相對(duì)定量分析(2-△△CT)來比較雞白痢沙門菌菌株S06004與其S

10、PI2缺失株S06004△SPI2在感染禽巨噬細(xì)胞HD112.5h、7.5h和15h時(shí)，這20個(gè)T3SS2效應(yīng)蛋白基因mRNA表達(dá)水平與S06004感染該細(xì)胞1.5h時(shí)這些基因mRNA表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示，這20個(gè)效應(yīng)蛋白基因包括假基因sifB、sspH2和steC在雞白痢沙門菌感染過程中均有不同程度的表達(dá);SPI2的缺失對(duì)基因cigR、gtgA、slrP、sopD、sseK1、steB和steC的表達(dá)并沒有顯著的影響，對(duì)基因pip

11、B2、sifB、sopD2、sseJ、 sseL、sspH2和steD的表達(dá)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著影響，而對(duì)基因pipB、steA和sifA的表達(dá)只在一個(gè)或兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著影響;缺失株感染時(shí)未檢測(cè)到基因sseF、sseG和spiC的表達(dá)。表明雞白痢沙門SPI2顯著影響一些T3SS2效應(yīng)蛋白基因的表達(dá)，而另一些效應(yīng)蛋白基因的表達(dá)并不受SPI2影響;假基因sifB、sspH2和steC在雞白痢沙門菌的感染過程中也可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄;缺失株感染時(shí)基因s

12、seF、sseG和spiC未表達(dá)與其位于SPI2上有關(guān)。這有助于進(jìn)一步揭示T3SS2及其效應(yīng)蛋白在雞白痢沙門菌感染過程中的致病機(jī)制，也為深入研究其功能提供了重要線索。
　　4.雞白痢沙門菌中T3SS2效應(yīng)蛋白基因分布研究
　　沙門菌T3SS2效應(yīng)蛋白基因在不同的沙門菌菌株中存在一定的差異性。本研究采用PCR方法檢測(cè)了在1962年至2013年間從我國(guó)分離的237株雞白痢沙門菌中25個(gè)T3SS2效應(yīng)蛋白基因的分布特征;同時(shí)，通過

13、序列比對(duì)分析了這25個(gè)基因在18株不同血清型沙門菌中的流行特征，它們的全基因組序列來自GenBank。PCR結(jié)果顯示，在這237株菌株中，基因cigR、pipB、pipB2、SlrP、SopD、sopD2、piC、sseF、sseG、SseJ、sseK1、sseL、steA、steB、SteC和steD均存在，gogB和SspH1均缺失，基因gtgA、tgE、SifA、sifB、sseI、sseK2和sspH2在這237株菌株中的檢出率

14、分別為99.6％、45.2％、98.7％、99.2％、5.9％、15.2％和97.5％;與1962年至1979年間相比，2000年至2013年間gtgE、sseI和sseK2的分布水平顯著降低。序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，有15個(gè)基因(cigR、pipB、pipB2、sifA、sifB、slrP、sopD、sopD2、spiC、sseF、sseG、sseL、steA、steC和steD)在這18株不同血清型沙門菌菌株中均存在，sifB、sse

15、K1、sspH2和steC在一些菌株中是以假基因的形式存在。結(jié)果表明，gtgE、sseI和sseK2在這237株菌株中分布具有一定的年代規(guī)律性;大部分被檢測(cè)基因在雞白痢沙門菌中具有廣泛分布;一些基因在微進(jìn)化過程中形成了假基因。這為進(jìn)一步分析相關(guān)基因的流行特征提供了重要線索，也為更加深入地研究這些效應(yīng)蛋白基因的功能及了解相關(guān)基因的進(jìn)化提供了數(shù)據(jù)。
　　5.雞白痢沙門菌T3SS2效應(yīng)蛋白CigR功能的初步解析
　　CigR既是一

16、個(gè)由沙門菌致病島3編碼的T3SS2效應(yīng)蛋白，也是一個(gè)膜蛋白。本研究采用λ-red同源重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌株S06004的cigR基因缺失株S06004△cigR，初步解析了CigR的基本功能。結(jié)果顯示，cigR的缺失不影響雞白痢沙門菌的生長(zhǎng)特性和生化特性，且該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，但能夠增強(qiáng)雞白痢沙門菌在禽巨噬細(xì)胞HD11和雞體內(nèi)的增殖和/或存活能力，顯著降低雞白痢沙門菌生物膜形成的能力;該缺失株對(duì)2日齡雛雞的LD50僅

17、是野生株的五分之一;另外，在雞白痢沙門菌感染HD11過程中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，cigR的缺失顯著影響CXCLI1、CXCLI2、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10和iNOS的產(chǎn)生，而對(duì)IL-4、IL-18、NF-kB1、TGF-β4和TNF-α的產(chǎn)生并沒有顯著影響。表明cigR的缺失引起雞白痢沙門菌毒力的顯著升高，顯著降低其生物膜形成的能力，并且CigR能夠顯著影響一些細(xì)胞因子、趨化因子及其它免疫相關(guān)因子